應用深度測序分析NRTI類交叉耐藥對河南長期二線抗病毒治療失敗者療效影響的研究.pdf

1、目的：獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)簡稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的一種危害性極大的傳染病，目前尚無法徹底根治。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（Highly active antiretroviral therapy，HAART）是目前世界范圍內(nèi)公認的對抗艾滋病最有效的療法。我國從2003年在全國范圍

2、內(nèi)廣泛推行一線抗艾滋病藥物，推薦采用的一線治療方案為2種核苷類抑制劑(Nucleotide Analogue ReverseTranscriptase Inhibitors，NRTIs)+1種非核苷類抑制劑(Nonnucleotide AnalogueReverse Transcriptase Inhibitors，NNRTIs)，具體用藥情況為齊多夫定/司他夫定(Zidovudine/Stavudine，AZT/D4T)+去羥基苷/拉

3、米夫定(Didanosine/Lamivudine，DDI/3TC)+依法韋侖/奈韋拉平(Efavirenz/Nevirapine，EFV/NVP)。但同發(fā)達國家相對豐富的藥物資源相比，我國一線所使用的抗病毒治療藥物較為單一，患者出現(xiàn)耐藥后很難及時更換藥物，這就導致了高耐藥率的產(chǎn)生。面對一線藥物嚴峻的耐藥形式，我國于2009年4月以河南省為試點開展二線抗病毒治療，二線抗病毒治療方案主要是1種蛋白酶抑制劑(Protease Inhibit

4、ors，PIs)+2種核苷類抑制劑(NRTIs)，即拉米夫定(3TC)+替諾福韋(Tenofovir，TDF)+克立芝(Lopinavir/ritonavir, Lpv/r)。截止目前，二線抗病毒治療方案已在我國實行了6年。從國內(nèi)目前現(xiàn)有的二線報道來看，換藥后12個月內(nèi)患者的CD4+T淋巴細胞較患者換藥前有所增長，病毒載量有所下降，短期內(nèi)治療效果良好。但尚缺乏針對更換二線藥物后長期治療效果的相關報道。本研究隊列的前期群體水平長期監(jiān)測結(jié)果

5、顯示195人更換藥物前病毒抑制率為34.6％。更換二線抗病毒藥物6個月后，隨訪157例，病毒載量抑制率升高到61.8％;隨訪12個月后病毒抑制率高達71.2％;隨訪第48個月的病毒抑制率為75.3％，且患者整體的CD4+T水平較換藥前有所升高，病毒載量水平較換藥前有所下降。然而仍舊存在少數(shù)患者經(jīng)長期二線治療但病毒學失敗(VL＞400copies/ml)，且常規(guī)基因型耐藥檢測未發(fā)現(xiàn)耐藥。排除依從性的影響后，我們推測由于二線治療方案中沿用了

6、一線方案中的NRTIs藥物3TC，一線治療失敗后累積的NRTIs耐藥可能以劣勢耐藥形式存在，使二線藥物方案中的NRTI類藥物3TC及TDF全部耐藥或者部分耐藥，從而導致二線治療失敗。本研究選取6名二線抗病毒治療6年但病毒學仍然失敗的患者，及9名長期治療效果好的患者作為對照，應用深度測序技術(shù)進行耐藥檢測，力求充分挖掘這些患者的NRTIs相關耐藥信息，明確長期二線抗病毒治療下NRTIs耐藥突變長期累積變異的特點及規(guī)律，及其對療效的影響，為我

7、國制定長期二線抗病毒藥物治療策略提供重要理論依據(jù)。
　　方法：采用回顧性隊列研究，選取的研究對象來自2009年8月-2010年1月于我國河南省尉氏縣建立的二線治療隨訪隊列，根據(jù)2007版《國家免費艾滋病抗病毒藥物治療手冊》中艾滋病病人更換二線方案的入選標準，研究隊列共納入120名患者，所有患者均簽署知情同意書。從此符合換藥標準的120名患者中回顧性地選取15名患者作為研究對象，入選標準如下:①換藥前基線基本信息完整②二線藥物服藥依

8、從性＞90％③換藥前的常規(guī)基因型耐藥結(jié)果顯示對3TC或TDF耐藥④治療時間滿48個月，根據(jù)第48個月或第72個月血漿病毒學結(jié)果，將這15人分為病毒抑制組(VL＜400copies/ml):9名患者，病毒未抑制組(VL＞400copies/ml):6名患者。具體技術(shù)路線為分別采集上述15名患者基線點及治療失敗的6名患者VL＞400copies/ml的隨訪點血液標本。收集15名患者人口學信息及各個血液標本所對應的CD4+T淋巴細胞計數(shù)、血漿

9、病毒載量及In-house耐藥檢測數(shù)據(jù)并進行NGS(Next Generation Sequencing)基因型耐藥檢測。應用FASTQC、Seqeuncher和Deepchek(@)-HIV等軟件對NGS數(shù)據(jù)進行下游分析和HIV耐藥基因注釋。另外，選取構(gòu)建好的10個質(zhì)控質(zhì)粒標本分別進行Sanger測序和深度測序，以Sanger測序的結(jié)果為金標準，評估深度測序每個堿基位置的錯誤率，并計算10個質(zhì)粒的平均錯誤率，以平均錯誤率95％可信區(qū)間

10、的下限作為Deepchek(@)-HIV軟件耐藥突變檢出的閾值。
　　結(jié)果：⑴基于NGS的HIV耐藥檢測明顯優(yōu)于傳統(tǒng)In-House方法，以Sanger測序的結(jié)果為金標準，NGS基因型耐藥檢測的錯誤率為1.23(1.01-1.45)，并確定1％為Deepchek(@)-HIV軟件耐藥位點檢出的閾值;本研究共產(chǎn)生6.5G的數(shù)據(jù)量，94.5％數(shù)據(jù)處于Q30以上水平，整個耐藥檢測區(qū)平均每個氨基酸的序列覆蓋度為23457條reads;15

11、名患者共檢測到308個耐藥相關位點，其中NGS和In-House共同檢測到175個耐藥位點，NGS額外檢測到127個耐藥位點。⑵更換二線抗病毒藥物前，病毒抑制組和未抑制組基線人口學信息、血漿病毒載量及CD4+T細胞計數(shù)無顯著性差異。⑶更換二線藥物前，病毒抑制組NRTIs耐藥突變多于未抑制組，但未達到統(tǒng)計學差異水平(P=0.07);嚴重影響3TC和TDF藥物敏感性的M184V、K65R位點僅在病毒抑制組中被發(fā)現(xiàn)，而低水平復制的F77L在兩

12、組均有發(fā)現(xiàn);另兩類藥物NNRTI和PI相關耐藥位點在兩組未見顯著性差異。⑷6名長期治療失敗患者個體水平的縱向隨訪耐藥結(jié)果顯示，換藥前基線NRTIs藥物耐藥相關位點的種類和準種比例隨著治療時間的延長呈遞減趨勢;NNRTIs耐藥位點同樣出現(xiàn)了下降趨勢但并不明顯，個別重要的NNRTIs耐藥位點K103S，G190A，Y181C一直維持到末次隨訪。未發(fā)現(xiàn)PIs主要耐藥位點。
　　結(jié)論：①深度測序檢測發(fā)現(xiàn)，二線抗病毒藥物長期治療失敗患者換藥