特發(fā)性和心臟損傷后縮窄性心包炎的纖維鈣化機制研究.pdf

1、目的：近年來，特發(fā)性和心臟損傷后縮窄性心包炎（Idiopathic and post-cardiac-injuryconstrictive pericarditis, IAPCP）的發(fā)病率逐年上升，已成為心包疾病防治領域中一個亟待解決的重要問題，也是影響心臟手術病人生存質(zhì)量的一個關鍵因素。最新研究進展表明心包纖維鈣化是IAPCP 產(chǎn)生心包縮窄癥狀的主要原因，但其具體的發(fā)病機制尚不清楚，臨床上無有效藥物和非手術干預方法。因而，我們以此為切

2、入點，從基因、細胞及組織三個不同的層面深入探索IAPCP 心包纖維鈣化的發(fā)病機制、初步嘗試針對性的干預實驗，旨在為今后IAPCP的臨床防治提供理論基礎和實驗數(shù)據(jù)。
　　 方法：為以上目的，本研究分為以下六部分。1. IAPCP 心包的分子病理研究：收集上海長海醫(yī)院資料完整、臨床病理診斷明確的IAPCP 心包標本共45例，其中特發(fā)性心包炎（Idiopathic constrictive pericarditis, ICP）43例，

3、心臟損傷后心包炎（Post-cardiac-injury constrictive pericarditis, PCP）2例。所有IAPCP 病例均有石蠟包埋組織，其中18例ICP 有新鮮標本、液氮保存。正常對照心包12例，均為液氮保存的新鮮標本。采用蘇木素-伊紅染色（Hematoxylin and Eosin, HE）觀察IAPCP 心包的組織學特征、維多利亞藍-苦味酸酸性復紅染色（Victoria blue-van Gieson,

4、VG）確定纖維化程度、Von Kossa 染色檢測心包內(nèi)鈣鹽沉積情況。采用免疫組織化學和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記（Termin Aldeoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, TUNEL）染色確定IAPCP的心包間質(zhì)細胞（PericardiAlinterstitiAlcells, PICs）表型的改變和凋亡的發(fā)生。抽

5、提新鮮組織標本的總RNA，qRT-PCR分析細胞外基質(zhì)相關基因表達的改變。2. TGF-β1在IAPCP 心包中的表達及對PICs的作用：采用western blot和免疫組織化學方法檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming growth factor-β1, TGF-β1）在IAPCP 心包中的表達豐度及細胞定位。分離培養(yǎng)正常對照心包的PICs，并給予TGF-β1因子；采用qRT-PCR分析TGF-β1處理前后PICs細胞外基

6、質(zhì)相關基因表達的改變；明膠酶酶譜法檢測明膠酶活性的改變；動態(tài)觀察TGF-β1誘導融合的PICs 形成鈣化結(jié)節(jié)的過程；免疫細胞化學染色、TUNEL 染色、Von Kossa 染色確定PICs表型的改變、凋亡及鈣鹽沉積情況；流式細胞儀和比色法定量凋亡率和鈣沉積程度。3. FGF-2、PDGF、BMP-2在IAPCP 心包中的表達及對PICs的作用：采用免疫組織化學方法檢測成纖維生長因子-2 （Fibroblast growth factor

7、-2, FGF-2）、血小板源性生長因子（Platelet-derived growthfactor, PDGF）和骨形成蛋白-2 （Bone morphogenetic protein-2, BMP-2）在IAPCP 心包中的表達；分離培養(yǎng)PICs，分別給予FGF-2、PDGF-AA、BMP-2 因子后，采用免疫細胞化學方法分析PICs表型的改變。4.自體心包瓣置換主動脈瓣：再次手術心包瓣的病理分析：對本科室所完成的15例自體心包瓣置

8、換主動脈瓣手術病人行長期隨訪；收集再次手術標本，采用HE、VG和免疫組織化學染色觀察自體心包瓣的病理組織學改變、檢測PICs的表型。5.PICs的生物學特征研究：分離培養(yǎng)PICs和人骨髓間充質(zhì)干細胞（MesenchymAlstem cells, MSCs）。觀察PICs的形態(tài)和生長特征，β-半乳糖苷酶染色檢測各代細胞中的衰老細胞。流式細胞儀分析PICs的免疫表型，特定培養(yǎng)基誘導PICs 向骨母、軟骨母細胞及脂肪細胞分化，通過免疫組織化學

9、、免疫細胞化學及油紅O 染色分析PICs的分化能力。MTT 法測定PICs和MSCs的細胞增殖活性，流式細胞儀分析兩種細胞的細胞周期分布。通過觀察成纖維細胞集落形成單位（Fibroblastic colony-forming unit, CFU-f）確定兩種細胞的自我更新能力；采用RT-PCR 方法比較兩種細胞表達自我更新相關基因的差異。6.Klf4逆轉(zhuǎn)心包肌纖維母細胞至PICs的研究：分離培養(yǎng)IAPCP的心包肌纖維母細胞，采用流式細胞

10、儀、β-半乳糖苷酶染色、原位凋亡染色等方法觀察肌纖維母細胞的生物學特征。給予Krüppel樣因子4 腺病毒（Adenovir AlKrüppel-like factor 4, AdKlf4）和增強型綠色熒光蛋白腺病毒（Adenovir Alenhanced green fluorescent protein, AdEGFP），熒光顯微鏡下觀察和流式細胞儀檢測確定細胞感染效率，免疫細胞化學檢測目標蛋白的表達。通過形態(tài)學觀察、β-半乳糖苷酶

11、染色、western blot、RT-PCR 確定Klf4逆轉(zhuǎn)心包肌纖維母細胞表型及降低膠原合成的能力，同時確定Klf4 減少細胞衰老、阻止衰老基因表達的可行性。
　　 結(jié)果：1.IAPCP心包的分子病理研究：HE和VG染色顯示纖維化和鈣化是IAPCP心包的主要病理改變，其中5例鈣化心包見骨化區(qū)域。免疫組織化學染色表明IAPCP心包的PICs異常轉(zhuǎn)分化，表達肌纖維母細胞表型標記物α-平滑肌肌動蛋白（α-Smoothmuscle

12、actin,α-SMA）和骨母細胞表型標記物堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）；3例無鈣化心包亦檢測到ALP陽性細胞，心包鈣化程度與PICs骨母細胞轉(zhuǎn)分化率成正相關（rs=0.7579,P<0.05）。TUNEL染色表明隨著鈣化程度的升高，凋亡率逐漸增多，心包鈣化程度與PICs的凋亡率成正相關（rs=0.4826,P<0.05）。qRT-PCR表明ICP心包中I型膠原和III型膠原的轉(zhuǎn)錄水平、金屬基質(zhì)蛋白酶-

13、2（Matrix metalloproteinase-2,MMP-2）/金屬基質(zhì)蛋白酶抑制物-2（Tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2）和MMP-9/TIMP-1的比率明顯高于正常對照心包，彈力蛋白的轉(zhuǎn)錄水平、MMP-1/TIMP-1和MMP-13/TIMP-1的比率降低（所有P<0.05）。2.TGF-β1在IAPCP心包中的表達及對PICs的作用：IAPCP心包表達TGF-β1

14、蛋白，其蛋白豐度與膠原/彈力比率（r=0.6585,P<0.05）和心包鈣化程度（rs=0.5328,P<0.05）呈正相關。細胞特異性免疫組織染色證實TGF-β1及其受體主要表達于PICs，提示TGF-β1以自-旁分泌的形式作用于PICs。體外模型證實TGF-β1促進PICs向肌纖維母細胞轉(zhuǎn)分化；在誘導細胞轉(zhuǎn)分化的同時，TGF-β1還上調(diào)細胞中I型膠原、III型膠原、MMP-2、MMP-8、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的轉(zhuǎn)錄

15、水平，并下調(diào)MMP-1和MMP-13的表達（所有P<0.05）。明膠酶酶譜法表明TGF-β1處理組的細胞上清中存在MMP-9和中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白（Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）的異源二聚體。給予TGF-β1，融合的PICs能自發(fā)性收縮、聚集生長、形成結(jié)節(jié)、表達ALP蛋白，在形成的結(jié)節(jié)中部分細胞凋亡壞死。與未處理的細胞相比，TGF-β1誘導的細胞結(jié)節(jié)表達較高的

16、ALP活性、含有更多的鈣鹽和凋亡細胞（所有P<0.05）。3.FGF-2、PDGF、BMP-2在IAPCP心包中的表達及對PICs的作用：免疫組織化學染色證實IAPCP心包表達FGF-2、PDGF和BMP-2蛋白，體外實驗表明FGF-2、PDGF-AA和BMP-2均能誘導PICs表達α-SMA，而且BMP-2還能誘導PICs表達ALP。4.自體心包瓣置換主動脈瓣：再次手術心包瓣的病理分析：隨訪結(jié)束時，瓣膜交界撕裂、心內(nèi)膜炎、瓣膜退行性變

17、（纖維化和/或鈣化）、再次手術的免除率分別為100％、93％、80％和67％，瓣膜相關的死亡率為0％。手術切除的自體心包瓣均行病理分析，結(jié)果表明自體心包瓣在宿主體內(nèi)5個月就被覆VIII因子陽性的內(nèi)皮細胞，內(nèi)皮下細胞表達α-SMA，HE和VG染色表明該瓣膜無明顯纖維化。因纖維鈣化而衰敗的心包瓣（n=3）中的PICs表達α-SMA，部分細胞表達ALP；VG染色顯示心包瓣的心室面有一層彈力板，這種彈力板見于主動脈瓣，但是正常心包和早期手術的心

18、包瓣中沒有。5.PICs的生物學特征研究：體外培養(yǎng)的PICs呈成纖維細胞樣外觀，在傳代過程中，細胞體積逐漸增大、變寬，衰老細胞增多，并逐漸表達α-SMA。細胞周期檢測表明隨著細胞代數(shù)的增加，細胞周期向G2/M～S期進展。PICs與MSCs相類似，表達粘附相關分子，同樣不表達造血干細胞標記物。細胞分化實驗證實PICs具有向骨母細胞、軟骨母細胞以及脂肪細胞分化的能力。PICs在培養(yǎng)的各個時間點的增殖活性均高于MSCs（P<0.05）。細胞周

19、期分析表明≈90％的MSCs處于細胞周期的G0/G1期；然而僅有≈64％的PICs處于細胞周期的G0/G1期。MSCs能夠不斷產(chǎn)生CFU-f，但是PICs的CFU-f形成效率低于MSCs（P<0.05）。RT-PCR證實MSCs和PICs均表達自我更新相關基因Oct3/4和Bmi-1，但是其在PICs的表達量低于MSCs。6.Klf4逆轉(zhuǎn)心包肌纖維母細胞至PICs的研究：與PICs相比，肌纖維母細胞多呈聚集樣生長，細胞扁平、寬大，表達α

20、-SMA，第一代衰老、凋亡細胞就明顯高于PICs。肌纖維母細胞感染Klf4腺病毒（AdenoviralKlf4,AdKlf4）后細胞逐漸失去聚集樣生長特征、并在傳代過程中由扁平細胞向梭形細胞轉(zhuǎn)變。AdKlf4感染早期（5天），細胞周期分析表明細胞周期阻滯。RT-PCR證實Klf4促進p53基因的轉(zhuǎn)錄、并抑制I型膠原和III型膠原的mRNA表達，而Klf4對α-SMA的表達則無明顯作用。腺病毒感染5周時，行westernblot和RT-P

21、CR檢測均證實Klf4下調(diào)α-SMA和p53的表達。
　　 結(jié)論：1.纖維化和鈣化是IAPCP心包最主要的病理學特征；纖維化表現(xiàn)為PICs向肌纖維母細胞轉(zhuǎn)分化、細胞外膠原沉積、彈力降解、MMPs和TIMPs的平衡失調(diào)；心包鈣化與PICs凋亡、骨母細胞轉(zhuǎn)分化相關，而且鈣化心包中有骨化區(qū)域，提示IAPCP的心包鈣化是多種機制參與的、由PICs介導的主動調(diào)控過程。2.通過研究TGF-β1、FGF-2、PDGF和BMP-2在IAPCP心

22、包中的表達及對PICs的作用，證實IAPCP心包纖維鈣化是多因素參與的主動調(diào)控過程，其中心環(huán)節(jié)為PICs向肌纖維母細胞和骨母細胞轉(zhuǎn)分化。3.在纖維鈣化的自體心包瓣中獲得PICs向肌纖維母細胞和骨母細胞轉(zhuǎn)分化的證據(jù)，1例無纖維化的心包中也檢測到PICs向肌纖維母細胞轉(zhuǎn)分化，提示PICs的異常轉(zhuǎn)分化是心包修復材料衰敗的始作俑者。4.通過對比PICs和MSCs的生物學特征，證實PICs具有MSCs相似的表型可塑性（即多向分化潛力），而這種可塑