SOCS3調(diào)控JAK2-STAT3信號(hào)通路在心肌慢性缺氧適應(yīng)中意義的研究.pdf

1、背景：
　　 紫紺型先心病是臨床常見(jiàn)的先天性畸形，心肌慢性缺氧是此類患者共同的病理生理過(guò)程。紫紺型先心病的手術(shù)時(shí)機(jī)的選擇往往會(huì)對(duì)患者預(yù)后產(chǎn)生重要的作用。但相對(duì)而言，紫紺型先心病的手術(shù)死亡率仍較高。在我國(guó)，紫紺型先心病的手術(shù)死亡率約為10％，而且1歲以內(nèi)及低體重紫紺型先心病患兒手術(shù)死亡率高已成為不可忽視的現(xiàn)象。
　　 基于以上思考，國(guó)家科技部已將先心病心肌缺氧適應(yīng)機(jī)制研究納入“十二五”醫(yī)學(xué)科技發(fā)展的目標(biāo)中，目的是更有效的降

2、低我國(guó)先心病治療的死亡率。心肌慢性缺氧適應(yīng)是維持先心病患兒心肌細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的關(guān)鍵，但是心肌慢性缺氧適應(yīng)的確切機(jī)制尚不清楚。因此深入研究紫紺型先心病的病理生理改變以及慢性缺氧條件下心肌細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)和適應(yīng)機(jī)制，將有望提高紫紺型復(fù)雜性先心病的臨床治療水平。
　　 對(duì)于心肌細(xì)胞缺氧適應(yīng)，我們既往已做過(guò)系列性研究，分別從缺氧心肌細(xì)胞中線粒體合成改變、缺氧自噬體形成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress）、未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）
　　

3、 改變、促紅細(xì)胞生成素受體（EPOR）表達(dá)改變以及腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）改變等方面闡述心肌細(xì)胞適應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的胞內(nèi)相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白、功能蛋白(酶)活性及代謝機(jī)能等等方面產(chǎn)生的適應(yīng)性調(diào)整，進(jìn)而重塑細(xì)胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)，能量供求平衡，以增加氧氣的釋放，并減低能量的消耗，使心肌重新獲得細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，保證細(xì)胞自身的存活和生長(zhǎng)，對(duì)抗缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞對(duì)慢性缺氧的適應(yīng)。作為最直接及最快速的細(xì)胞反應(yīng)機(jī)制中，細(xì)胞信號(hào)通路的改變往往是一切適

4、應(yīng)性改變的開(kāi)始環(huán)節(jié)，其活化或持續(xù)性活化必然會(huì)導(dǎo)致其下游的信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而影響細(xì)胞接下來(lái)的適應(yīng)性改變，如形態(tài)、代謝、凋亡等等方面，且一旦這種適應(yīng)性調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)形成后，何種機(jī)制可以打斷它的穩(wěn)定運(yùn)行，何時(shí)何種生物學(xué)指標(biāo)可以提示缺氧適應(yīng)平衡穩(wěn)態(tài)已崩潰是目前紫紺型先心病病理生理機(jī)制研究的重點(diǎn)。因?yàn)閷?duì)這些適應(yīng)穩(wěn)態(tài)的改變的掌握往往決定著紫紺型先心病患兒的疾病的轉(zhuǎn)歸，手術(shù)時(shí)機(jī)的選擇及術(shù)后患者的預(yù)后。目前對(duì)于慢性缺氧心肌細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)分子系統(tǒng)產(chǎn)生怎樣的

5、適應(yīng)性改變，如何產(chǎn)生這種適應(yīng)調(diào)整的機(jī)制尚不清楚。
　　 細(xì)胞因子信號(hào)抑制家族(supressors of cytokine signaling， SOCS)有SOCS1-SOCS7和CIS 共8種成員。SOCS3蛋白家族是Janus 激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子STAT（Janus kinase/signAltransducer and activator)信號(hào)通路激活的靶基因產(chǎn)物，特異性地負(fù)反饋抑制的JAK/STAT通路活化。J

6、AK/STAT信號(hào)通路受細(xì)胞因子(如IL-6及TNF-a)激活后，積極參與心肌自我適應(yīng)性調(diào)整的各個(gè)環(huán)節(jié)如：早期缺血預(yù)處理的心肌保護(hù)、心肌重構(gòu)及終末期擴(kuò)張型心肌病的心肌功能維持，是心肌細(xì)胞中重要的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定因子。但正常的心肌細(xì)胞中SOCS3-JAK/STAT通路是不表達(dá)的，說(shuō)明JAK/STAT通路在正常心肌中是不激活的，SOCS3基因作為胚胎時(shí)期表達(dá)的基因(ontogene)在非應(yīng)激情況下不參與心肌細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)調(diào)控。JAK/STAT通路是

7、否參與心肌慢性缺氧適應(yīng)機(jī)制目前研究并不十分清楚，其下游調(diào)節(jié)因子的變化在心肌細(xì)胞達(dá)到缺氧適應(yīng)平衡時(shí)的變化情況目前尚無(wú)報(bào)道。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧處理后NF-κB 可以活化，且與心肌缺血預(yù)適應(yīng)及一些藥物預(yù)處理的保護(hù)作用有關(guān)。最新的研究表明：
　　 持續(xù)性表達(dá)的STAT3的磷酸化可以穩(wěn)定的持續(xù)激活NF-κB 活化進(jìn)核，其活化的RelA的亞基的乙?；螒B(tài)(AC-RelA)表達(dá)同樣受磷酸化的p-STAT3的活化調(diào)控。因此本課題

8、擬闡明在慢性缺氧條件下SOCS3-IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)系統(tǒng)與NF-κB信號(hào)系統(tǒng)相互交聯(lián)參與調(diào)控心肌細(xì)胞適應(yīng)的作用機(jī)制。
　　 目的：
　　 本研究的目的在于驗(yàn)證以下假說(shuō)：在慢性缺氧心肌細(xì)胞中：1)IL-6-STAT3蛋白和NF-κB信號(hào)通路激活的持續(xù)穩(wěn)定; 2)STAT3/NF-κB 相互協(xié)調(diào)作用存在，共同介導(dǎo)心肌細(xì)胞抗凋亡作用；3)SOCS3的表達(dá)可以被缺氧刺激誘導(dǎo)，它會(huì)抑制STAT3的過(guò)度激活和調(diào)節(jié)NF

9、-κB的激活，形成有序的信號(hào)表達(dá)穩(wěn)態(tài)。
　　 研究方法：
　　 本研究符合醫(yī)學(xué)道德倫理規(guī)范，共分三部分：
　　 第一部分：選取紫紺型(紫紺組，n=18)和非紫紺型(非紫紺組，n=22)先天性心臟病患兒，收集手術(shù)中切除的肥厚右室流出道心肌組織。Western blotting及免疫組化觀察IL-6，NF-κB p65 (acetyl K310)， SOCS3， STAT3， phosphor-Tyr-705-STA

10、T3和phosphor-Ser-276-NF-κB p65在心肌組織中的表達(dá)情況；提取心肌組織的總RNA，采用ReAltime RT-PCR 檢測(cè)IL-6 mRNA，C-myc mRNA和SOCS3 mRNA表達(dá)水平；
　　 EMSA 法檢測(cè)心肌組織中NF-κB 活化情況；ELISA 檢測(cè)先天性心臟病患兒外周血IL-6濃度。
　　 第二部分：體外培養(yǎng)H9c2大鼠心肌細(xì)胞株，將細(xì)胞暴露于1％ O2、5％ CO2的環(huán)境中建立

11、缺氧細(xì)胞模型，培養(yǎng)不同時(shí)間段后(分為缺氧6h組， 12h組， 24h組， 48h組， and 72h組)，Western blot 檢測(cè)NF-κB p65 (acetyl K310)，SOCS3，STAT3，phosphor-Tyr-705-STAT3和phosphor-Ser-276-NF-κB p65在心肌組織中的表達(dá)情況；提取心肌組織的總RNA，采用ReAltime RT-PCR 檢測(cè)IL-6 mRNA， C-myc mRNA和S

12、OCS3 mRNA表達(dá)水平；ELISA 檢測(cè)體外培養(yǎng)各組心肌細(xì)胞株上清液中IL-6濃度。
　　 第三部分：建立SOCS3 穩(wěn)定表達(dá)H9c2細(xì)胞株，給予轉(zhuǎn)染SOCS3 質(zhì)粒的上述細(xì)胞缺氧處理，檢測(cè)第二部分實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的變化；同時(shí)通過(guò)檢測(cè)缺氧處理72h后轉(zhuǎn)染SOCS3質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組間不同的生物活性：細(xì)胞凋亡檢測(cè)(凋亡率(TUNEL)試驗(yàn)/Hoest 活細(xì)胞染色)；細(xì)胞活性檢測(cè)（MTT 試驗(yàn)）；細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中LDH (乳酸脫氫酶)濃

13、度的差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、在紫紺型先心病患者心肌組織中觀察到STAT3及NF-κB信號(hào)系統(tǒng)均活化，其正性調(diào)節(jié)因子IL-6及負(fù)性調(diào)控因子SOCS3 均處于高表達(dá)狀態(tài)，這種高表達(dá)的信號(hào)通路對(duì)心肌細(xì)胞慢性缺氧適應(yīng)可能具有重要的作用；
　　 2、慢性缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞中，p-Ser-276-NF-κB p65、p-Tyr-705-STAT3、STAT3、SOCS3、NF-κB p65(acetyl K310)蛋白

14、表達(dá)均隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸升高，后呈穩(wěn)定表達(dá)狀態(tài)，維持在高水平。隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路的靶基因SOCS3和C-myc 以及NF-κB信號(hào)通路的靶基因IL-6 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平也同樣表現(xiàn)出先逐漸升高后穩(wěn)定在高活性水平的趨勢(shì)，說(shuō)明隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，以上信號(hào)通路的改變是細(xì)胞為適應(yīng)缺氧刺激的而做出的適應(yīng)性改變；
　　 3.外源性的SOCS3 明顯減低慢性缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞中p-Ser-276-NF-

15、κB p65、p-Tyr-705-STAT3、NF-κB p65(acetyl K310)蛋白在核內(nèi)的表達(dá)水平；同樣過(guò)表達(dá)的SOCS3 明顯減低IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路的靶基因C-myc mRNA 以及NF-κB信號(hào)通路的靶基因IL-6 mRNA 轉(zhuǎn)錄，說(shuō)明外源性過(guò)表達(dá)的SOCS3 明顯抑制STAT3信號(hào)通路與NF-κB信號(hào)在細(xì)胞核內(nèi)存在信號(hào)交聯(lián)。外源性的SOCS3對(duì)兩種信號(hào)通路抑制的效果使心肌細(xì)胞面對(duì)缺氧刺激出現(xiàn)細(xì)胞凋亡

16、明顯增高（TUNEL 檢測(cè)），細(xì)胞膜穩(wěn)定（LDH分泌增加）明顯降低，細(xì)胞活性明顯減低，失去了對(duì)缺氧的適應(yīng)，說(shuō)明打破信號(hào)穩(wěn)態(tài)對(duì)心肌細(xì)胞的存活及活性有明顯的不利影響。
　　 綜上所述，紫紺型先心病患者心肌組織中及缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞中STAT3及NF-κB信號(hào)系統(tǒng)活性增強(qiáng)，存在核內(nèi)相互協(xié)調(diào)作用，維持心肌細(xì)胞對(duì)缺氧刺激的適應(yīng)，作為正反饋因子IL-6的旁分泌作用有效的維持信號(hào)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)表達(dá)，而作為重要的負(fù)反饋因子SOCS3的穩(wěn)態(tài)表達(dá)，有效有