深海來源無活性野生株雜色曲霉ZBY-3的活性突變株篩選與突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物研究.pdf

1、在特殊生境下提取的微生物活性產(chǎn)物研究中，在篩選得到能夠產(chǎn)生生物活性代謝產(chǎn)物的微生物過程中，僅有少量的微生物菌株能產(chǎn)生相應(yīng)的活性，并可以直接應(yīng)用于次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究，而絕大多數(shù)菌株則在相應(yīng)的篩選模型中沒有表現(xiàn)出相應(yīng)的活性。如何改造這些無活性菌株的次級(jí)代謝功能，進(jìn)而使其有效地轉(zhuǎn)化為活性菌株，并產(chǎn)生相應(yīng)的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，是本課題所需要研究的重點(diǎn)。核糖體工程及其相關(guān)的抗生素抗性篩選技術(shù)已被成功地應(yīng)用在了調(diào)控原核微生物領(lǐng)域微生物的次級(jí)代謝功能改

2、造上，而通過氨基糖苷類抗生素抗性篩選將無活性真菌野生株轉(zhuǎn)化成活性突變株，僅在本課題組前期工作中，探索性地應(yīng)用在特殊生境的潮間帶真菌產(chǎn)紫青霉G59上，本研究在此基礎(chǔ)之上，將抗生素抗性導(dǎo)入真菌細(xì)胞的技術(shù)應(yīng)用到另一株深海來源的無活性野生真菌，使其發(fā)生活性化轉(zhuǎn)化，得到穩(wěn)定的具有活性的抗性突變株，通過抗性驗(yàn)證，證明其抗性被穩(wěn)定的導(dǎo)入，再通過發(fā)酵分離得到新產(chǎn)活性化合物并驗(yàn)證之，最終闡明了突變株新產(chǎn)活性產(chǎn)物的研究。
　　本論文以從采集于174.

3、2130°E，24.3444°S(南太平洋斐濟(jì)周邊大洋)，水深800米處海泥中提取的無活性真菌ZBY-3，經(jīng)分類學(xué)研究鑒定該菌株為雜色曲霉(Aspergillus versicolor)。采用DMSO與超聲介導(dǎo)下的不同濃度的新霉素抗性篩選方法獲取突變株，并對(duì)突變株進(jìn)行了抗細(xì)菌、抗腫瘤活性篩選。在此基礎(chǔ)上對(duì)其中1株活性突變株進(jìn)行了新產(chǎn)活性產(chǎn)物的研究。
　　分離得到雜色曲霉ZBY-3，采用MTT法，以人白血病K562細(xì)胞為受試細(xì)胞，經(jīng)

4、初篩和復(fù)篩，在100μg/mL樣品濃度下沒有抗腫瘤作用。這一株無活性菌株則為探索二次開發(fā)無活性菌株的相關(guān)研究提供了有效的原始菌株。
　　采用超聲、DMSO不同的介導(dǎo)方法，對(duì)含有不同濃度新霉素的孢子懸液進(jìn)行處理，結(jié)果證實(shí)DMSO介導(dǎo)新霉素的抗性篩選方法能獲取突變株。通過對(duì)菌懸液處理時(shí)間、DMSO體積濃度比、新霉素濃度等因素進(jìn)行考察，進(jìn)一步完善與補(bǔ)充了DMSO介導(dǎo)的新霉素抗性導(dǎo)入無活性真菌篩選方法，運(yùn)用氨基糖苷類抗生素對(duì)真菌進(jìn)行抗性篩

5、選，從而將無活性真菌轉(zhuǎn)化為活性菌株資源。
　　通過建立的DMSO介導(dǎo)的新霉素抗性篩選方法對(duì)無活性深海來源真菌雜色曲霉ZBY-3進(jìn)行處理，共分離得到了33株的在形態(tài)學(xué)上有差異的抗性突變株，其中的12株的發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯提取物在100μg/mL時(shí)對(duì)人慢性髓源性白血病細(xì)胞K562細(xì)胞有大于30％的抑制增殖生長(zhǎng)的活性（占總的抗性突變株數(shù)目的36.4％），并且通過TLC薄層分析，可以看出活性突變株的次級(jí)代謝產(chǎn)物中，生成了原始菌株ZBY-3

6、所不能代謝產(chǎn)生的物質(zhì)，這些結(jié)果表明，利用本章節(jié)所表述的研究方法，通過DMSO介導(dǎo)下的新霉素導(dǎo)入無活性深海真菌，確實(shí)能夠改造原始菌株，并獲得新的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，從而拓展可供研究活性產(chǎn)物的菌株來源。
　　另一方面，通過建立的超聲介導(dǎo)下的高濃度新霉素抗性篩選方法對(duì)無活性深海來源真菌雜色曲霉ZBY-3進(jìn)行處理，共分離得到了30株的在形態(tài)學(xué)上有差異的抗性突變株，通過一系列的抗腫瘤細(xì)胞活性測(cè)試、抗菌活性測(cè)試，17株抗性突變株的次級(jí)代謝產(chǎn)物在

7、100μg/mL濃度下對(duì)K562細(xì)胞抑制率超過30％，活性轉(zhuǎn)化率達(dá)56.7％，其中的10株次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)K562細(xì)胞的抑制率穩(wěn)定大于50％，另外的7株次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)K562細(xì)胞的抑制率穩(wěn)定地介于30％到50％;6株抗性突變株的次級(jí)代謝產(chǎn)物在紙片法測(cè)量抑菌活性的實(shí)驗(yàn)中，750μg/紙片的濃度下，有6株抗性突變株對(duì)大腸埃希菌ATCC(@)25922有抑菌活性，活性轉(zhuǎn)化率達(dá)到20％。結(jié)合TLC與HPLC-PDAD-UV對(duì)比圖，以及結(jié)合抗性突變

8、株的活性強(qiáng)弱，基于產(chǎn)物的豐富程度，我們選擇了200-2003h1-2作為下一步次級(jí)代謝產(chǎn)物研究的對(duì)象。
　　針對(duì)活性突變株200-2003h1-2，我們開展了抗性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在同樣條件下對(duì)原始菌株ZBY-3和目標(biāo)菌株200-2003h1-2同時(shí)進(jìn)行抗性試驗(yàn)，從而驗(yàn)證了200-2003h1-2的新霉素抗性被成功導(dǎo)入。進(jìn)而對(duì)抗性突變株進(jìn)行大量發(fā)酵，并通過活性追蹤的方法，將抗性突變株的次級(jí)代謝產(chǎn)物與原始菌株進(jìn)行比對(duì)，分離并且純化原始菌株所

9、不產(chǎn)的，突變株代謝產(chǎn)物中所新產(chǎn)的6個(gè)單體化合物:Cyclo(D-Pro-D-Phe)(1)、Cyclo-(D-tyrosyl-D-proline)(2)、Phenethyl5-oxoprolinate(3)、Cyclo(L-Ile-L-Pro)(4)、Cyclo(L-Leu-L-Pro)(5)、3β,5α,9α-Trihydro xy-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6-one(6)，其中化合物2是新天然產(chǎn)物，化

10、合物3為新化合物。這些產(chǎn)物在100μg/mL對(duì)K562，HL60，BGC-823，Hela細(xì)胞均有或弱或強(qiáng)的抗腫瘤活性。其中化合物1，2，6對(duì)K562細(xì)胞的IC50值分別為399.5μM(1)，303.7μM(2)，221.0μM(6)，化合物1，2，3，6對(duì)HL-60細(xì)胞的IC50值分別為225.6μM(1)，254.7μM(2)，215.1μM(3)，89.1μM(6)，化合物1，2，6對(duì)BGC-823細(xì)胞的IC50值分別為242.

11、2μM(1)，328.7μM(2)，177.7μM(6)，化合物3，6對(duì)Hela細(xì)胞的IC50值分別為194.5μM(3)，224.3μM(6)，并且通過HPLC-MS驗(yàn)證了這六個(gè)化合物為原始菌株所不生產(chǎn)，而是抗性突變株所新生產(chǎn)的。
　　總而言之，在本研究中，以深海來源無活性野生菌株為原始菌株，在通過DMSO與超聲介導(dǎo)下的新霉素抗性導(dǎo)入真菌的基礎(chǔ)上，通過體外篩選模型的篩選，實(shí)現(xiàn)了無活性菌株的活性化轉(zhuǎn)化，并獲得了活性突變株，并闡明了