海洋來源產(chǎn)紫青霉G59的新霉素抗性突變株4-30新產(chǎn)抗腫瘤活性產(chǎn)物研究.pdf

1、微生物代謝產(chǎn)物是新藥及其先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的重要來源，其中真菌次級代謝產(chǎn)物因具有豐富的化學(xué)多樣性倍受人們關(guān)注。然而在對野生真菌進行活性篩選時，絕大多數(shù)菌株因不具備相關(guān)的生物學(xué)活性而被棄置，造成了大量自然資源的浪費。微生物基因組學(xué)的研究表明，在常規(guī)的培養(yǎng)條件下，大多數(shù)次級代謝相關(guān)基因（簇）處于沉默狀態(tài)，不能進行表達產(chǎn)生相應(yīng)的次級代謝產(chǎn)物。近年來，本課題組圍繞如何激活真菌中沉默的次級代謝途徑，建立了一系列簡便而有效的實驗技術(shù)新方法，包括 DMSO介導(dǎo)

2、的硫酸二乙酯誘變，超聲介導(dǎo)的抗生素抗性導(dǎo)入，以及DMSO介導(dǎo)的抗生素抗性導(dǎo)入等。最近，本課題組又通過以無抗腫瘤活性的海洋來源產(chǎn)紫青霉 G59作為原始菌株，采用 DMSO介導(dǎo)的新霉素抗性篩選方法，獲得了數(shù)十株具有抗腫瘤活性的新霉素抗性突變株。本文通過對 DMSO介導(dǎo)新霉素抗性篩選所得到的3株突變株進行抗性驗證實驗，對突變株的新霉素抗性導(dǎo)入情況進行確認。在此過程中，將新霉素抗性突變株4-30、PDN-10-2、PDN-v-2及其相應(yīng)對照原始

3、菌 G59的新鮮孢子液，用新霉素分別按篩選獲取各突變株時處理G59孢子所采用相同實驗條件進行處理，然后涂布于PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)并逐日觀察。對比原始菌 G59與突變株在生長狀態(tài)上的差別，發(fā)現(xiàn)原始菌G59的生長受到了明顯的抑制，而突變株的生長則無明顯抑制，表明突變株已獲得了新霉素抗性，抗性篩選實驗取得了成功。從課題組前期獲得的突變株中挑選8株活性突變株，進行了抗腫瘤活性復(fù)篩，以考察突變株的活性穩(wěn)定性。對8株新霉素突變株的發(fā)酵提取物進

4、行HPLC分析，觀察對比突變株與原始菌代謝產(chǎn)物的差異。最終，從這8株突變株中選擇了活性穩(wěn)定，代謝產(chǎn)物豐富并與原始菌G59差異明顯的突變株4-30作為繼續(xù)研究的對象。
　　對突變株4-30分別進行了液體培養(yǎng)基以及固體培養(yǎng)基的大量發(fā)酵，并從中選擇性地分離在原始菌 G59中不產(chǎn)而在突變株中新產(chǎn)，且具有抗腫瘤活性的次級代謝產(chǎn)物。在對突變株4-30液體培養(yǎng)基大量發(fā)酵的研究中，首先進行了發(fā)酵時效考察的預(yù)實驗，初步明確了發(fā)酵培養(yǎng)的最佳時間。在具

5、體的產(chǎn)物分離過程中采用了化學(xué)分析檢測引導(dǎo)活性追蹤分離的手段，綜合利用各種分離分析技術(shù)，從中獲得了5個具有抗腫瘤活性的新產(chǎn)化合物（化合物1-5）。為了進一步考察突變株4-30的代謝能力，更加深入地挖掘突變株的新產(chǎn)活性次級代謝產(chǎn)物，我們對突變株4-30進行了固體培養(yǎng)基的大量發(fā)酵。產(chǎn)物分離采用與之前相同的策略，獲得了4個具有抗腫瘤活性的新產(chǎn)化合物（化合物6-9）。綜合應(yīng)用現(xiàn)代波譜技術(shù)（UV、IR、CD、NMR等）以及改良Mosher方法對上述

6、化合物1-9的結(jié)構(gòu)進行闡明。化合物6為新結(jié)構(gòu)化合物，屬于自然界罕見的Cyclopentachromones(CPCs)類化合物，在其結(jié)構(gòu)中存在一含硫側(cè)鏈，并通過硫醚鍵的形式來與母核中脂肪環(huán)部分相連接，這樣的結(jié)構(gòu)在CPCs類化合物中尚屬首次發(fā)現(xiàn)。根據(jù)HMBC譜中提供的信號，可知化合物6在五元環(huán)上取代基的位置也具有一定獨特性，與之前所報道過的該類化合物取代的位置均不相同。通過對母核中遠程 C-H偶合常數(shù)的分析，結(jié)合Karplus方程的計算，

7、確定了骨架中C-2與C-3的相對結(jié)構(gòu)，進一步通過計算簡化結(jié)構(gòu) ECD，并與實驗測量 CD進行比對分析，確定了五元環(huán)上的絕對構(gòu)型。經(jīng)改良Mosher法實驗，確定了化合物6側(cè)鏈C-17位連羥手性碳的絕對構(gòu)型。通過對化合物6同類化合物生合成規(guī)律的分析，分別找出了骨架結(jié)構(gòu)與側(cè)鏈前體的來源，并對其可能的生合成途徑進行合理的推測。
　　聯(lián)合使用HPLC-PDAD-UV與HPLC-ESI-MS的分析方法，以上述分離得到的單體化合物1-9作為參照

8、，對原始菌G59以及突變株4-30液、固體培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯提取物在同樣的實驗條件下進行產(chǎn)物檢測分析。實驗結(jié)果顯示，化合物1-9均在突變株4-30的發(fā)酵樣品中檢測到，而在原始菌G59的發(fā)酵樣品中則沒有檢測到，表明化合物1-9均為突變株4-30中新產(chǎn)的次級代謝產(chǎn)物。這說明突變株4-30在引入抗性的過程中激活了原本在G59中沉默的次級代謝相關(guān)途徑，根據(jù)所得到的化合物結(jié)構(gòu)特點來看，這其中可能包括聚酮合成酶途徑（PKS）以及非核糖體肽合成酶

9、途徑（NPRS）以及其它復(fù)雜的生合成途徑。正是這些原本沉默的相關(guān)次級代謝合成途徑的被激活，導(dǎo)致突變株4-30獲得了可代謝產(chǎn)生原本在G59中所不能產(chǎn)生，且具有一定抗腫瘤活性的次級代謝產(chǎn)物的能力。
　　以人癌細胞K562、HL-60、BGC-823、Hela以及MCF-7作為受試對象，分別對單體化合物1-9進行初步抗腫瘤活性測試。100μg/mL濃度下化合物1-9對不同的腫瘤細胞作用24小時后，均顯示出一定的抑制活性，抑制率介于27％

10、~89%，相同濃度陽性參照5-氟尿嘧啶對腫瘤細胞抑制率介于42%~47%。化合物1-3,5-7,9還分別進行了IC50值的測試。其中新化合物6顯示出了良好的抗腫瘤活性，對上述五種人癌細胞的IC50值介于16~75μM之間。
　　總之，通過 DMSO介導(dǎo)的新霉素抗性篩選，可以將原本無抗腫瘤活性的產(chǎn)紫青霉G59轉(zhuǎn)化成具有抗腫瘤活性的突變株。隨著突變株4-30新霉素抗性的引入，次級代謝相關(guān)途徑較原始菌 G59發(fā)生了改變，因而可以從其代謝