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文檔簡介
1、目的:截至目前,瘧疾仍然是具有嚴重臨床癥狀的瘧原蟲感染性疾病。據(jù)2016年瘧疾報告所述,2015年全世界有2.12億瘧疾新病例和42.9萬例瘧疾死亡病例。特別是在非洲等發(fā)展中國家,瘧疾仍然是5歲以下兒童死亡的主要原因。近些年臨床上瘧疾治療藥物氯喹和青蒿素的聯(lián)合應(yīng)用,使瘧疾得到有效的控制。然而,仍然有將近40%的世界人口受到間日瘧威脅,每年引起130多萬例臨床感染。隨著瘧原蟲對一些抗瘧藥耐藥性的反復出現(xiàn)和按蚊對于殺蟲劑的抵抗性,研發(fā)有效的
2、瘧疾疫苗是重要且難以攻克的課題。目前瘧疾疫苗可分為三種分別是:子孢子疫苗、肝期疫苗、紅內(nèi)期疫苗和傳播阻斷疫苗。傳播阻斷疫苗(Transmission-blocking vaccines TBVs)雖然不能直接阻止瘧原蟲的感染,但能夠阻止瘧原蟲通過媒介按蚊從感染者到未感染者的傳播從而阻斷瘧疾在人類宿主和蚊子之間的傳播并且其候選抗原主要表達于蚊階段的蟲體表面,機體產(chǎn)生抗體后阻斷蚊胃中瘧原蟲的發(fā)展進而切斷瘧原蟲的傳播。
瘧疾傳播阻斷
3、疫苗的基本原理是用瘧原蟲在蚊階段的表面抗原免疫個體,引起機體免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體,干擾瘧原蟲在蚊體內(nèi)的后續(xù)發(fā)育周期,改變瘧原蟲在蚊體內(nèi)的生活循環(huán),從而切斷瘧疾的傳播。瘧疾的傳播最主要在于按蚊成功攝取含有雌雄配子體的患者外周血液。在蚊體內(nèi)的中腸部位,雌雄配子體受精變?yōu)楹献印:献咏?jīng)過受精后變?yōu)榫哂羞\動能力的動合子,動合子進入中腸上皮發(fā)育成卵囊。大量的研究已經(jīng)證實天然產(chǎn)生和疫苗誘導的抗體在血液中被攝入到蚊體內(nèi)后,能夠抑制配子體在蚊子中腸部位的發(fā)育
4、階段(受精,動合子和卵囊的發(fā)育),進一步阻礙瘧原蟲生活史的完成。傳播阻斷疫苗目的在于干擾瘧原蟲在蚊體內(nèi)的有性生殖階段。盡管傳播阻斷疫苗在瘧疾控制中有至關(guān)重要的作用,但研究進展依然緩慢,能夠完全阻止瘧傳播的高效疫苗還沒有研究出來,因此亟需加強這方面的研究。迄今為止,僅有一少部分候選蛋白顯示出較好的傳播阻斷活性,包括表達于配子體與配子階段的P48/45和P230,表達于合子與動合子階段的P25/P28以及表達于蚊階段的HAP2等,但是其臨床
5、效果很難達到控制和消除瘧疾的目的,所以完成消滅瘧疾的目標任重而道遠。因此,我們認為仍要發(fā)現(xiàn)跟多的新的傳播阻斷候選抗原進而研制高效并且經(jīng)濟實惠的抗瘧疫苗,才是消滅瘧疾的根本可行的方法。
我們使用良好的特性和更易于操控的鼠瘧-伯氏瘧原蟲(Plasmodium bergheiANKA)做初步篩選。通過生物信息學分析瘧原蟲數(shù)據(jù)庫并從中主要選擇在有性生殖階段表達的膜表面蛋白PBANKA_145770(PSOP26),截取其優(yōu)勢抗原表位區(qū)
6、部分,通過直接免疫重組蛋白后的血清抗體來進行驗證、評價所選蛋白的抗原性和免疫原性,通過免疫學實驗技術(shù)確定PSOP26在伯氏瘧原蟲表達的位置。為了發(fā)掘出PSOP26的基因功能,運用基因重組技術(shù)敲除伯氏瘧原蟲基因組中的PSOP26,并探究其在蚊體內(nèi)對瘧原蟲發(fā)育的影響。通過以上所提出的實驗方案,來評定TBVs候選抗原是否具有較高傳播阻斷效果,能否成為優(yōu)秀的傳播阻斷疫苗的候選抗原,為人體瘧疾疫苗的研制和開發(fā)提供新的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
7、 研究方法:1、傳播阻斷疫苗候選蛋白的生物信息學分析。在瘧原蟲數(shù)據(jù)庫PlasmoDB選取候選基因后BLAST進行基因序列的比對,根據(jù)SMART排除信號肽和結(jié)構(gòu)域的部分,再用ClustalW對其多重序列比對,最后用MAGA5做進化樹分析,確定了1種有性階高度保守的瘧原蟲膜蛋白,PBANKA_145770(POSP26),DNA長為1065bp,蛋白分子量為42614Da,含有一個信號肽及多個跨膜域和多個低復雜區(qū)。
2、設(shè)計和構(gòu)建
8、候選蛋白的原核表達載體。6-8周齡,雌性BALB/c小鼠經(jīng)腹腔感染分別感染5×106 Plasmodium berghei ANKA寄生紅細胞,配子體多的第四天并提取小鼠含全蟲血的基因組DNA。根據(jù)原核表達載體的生物學特點設(shè)計引物,以DNA為模板擴增基因片段,將克隆后的產(chǎn)物通過T4連接酶連接到載體pET32a(+)中,再將原核表達載體轉(zhuǎn)化到Escherichia coli表達的菌株BL-21中,選擇陽性菌落并通過PCR技術(shù)確定大小后送生
9、物技術(shù)公司測序鑒定。
3、重組蛋白的表達與純化。將正確構(gòu)建的帶有His標簽的PSOP26轉(zhuǎn)入Escherichia col表達的菌株BL-21中,選擇陽性克隆菌落并在Luria-Bertani液體培養(yǎng)基中經(jīng)過蛋白誘導劑IPTG誘導后大量表達,然后通過SDS-PAGE電泳法確定其正確性后,在利用親和層析法純化r PSOP26重組蛋白并確定濃度。
4、實驗動物處理和血清制備。重組蛋白免疫:BALB/c(6~8周齡,雌性)
10、,隨機分為實驗組對照組各十只。實驗組給予重組蛋白(50μg/小鼠)與弗氏完全佐劑混合,免疫小鼠。每兩周再次進行一次加強免疫。對照組在相同時間給予相同劑量。留取血清:于第一次免疫后的14,28,42天,將血收集并留血清置于-80℃冰箱保存。
5、免疫血清抗體滴度檢測-ELISA。將PBS稀釋的8μg/ml重組蛋白包被酶標板每個孔100μl,4℃冰箱保存12小時,再用200μl含1%BSA的PBS,37℃恒溫封閉1小時,PBS洗3
11、次后每孔加入倍比稀釋不同免疫時間段小鼠血清100μl,37℃溫箱2小時,PBST(含0.1%Tween20)洗3次,加入1∶5000稀釋的HRP偶聯(lián)的羊抗鼠IgG,37℃溫箱1小時,PBST洗3次,最后加入鄰苯二胺和過氧化氫并顯色,50μl H28O4終止反應(yīng)后在酶標儀檢測OD490nm數(shù)值。
6、制備不同階段Plasmodium berghei ANKA的蟲抗原。裂殖體:含5×106個Plasmodium berghei A
12、NKA感染6-8周齡BALB/c約第十二天的感染率達到5~10%后用4%水合氯醛麻醉小鼠,眼球取血,過CF11粉末柱去除白細胞,培養(yǎng)基稀釋的55%(V/V) Nycodenz密度梯度離心分離,25℃,2000rpm,20分鐘,緩慢吸取中間灰白層裂殖體。配子體:感染4天后,連續(xù)2天給小鼠添加含有磺胺嘧啶的飲用水。第6天的血液只含有豐富的配子體,培養(yǎng)基稀釋的48%(V/V)Nycodenz進行密度梯度離心分離,37℃,2000rpm離心20
13、分鐘,收集中間灰白層配子體。動合子:小鼠感染第3天,心臟采血,混合血液與動合子培養(yǎng)基(RPMI1640,50mg/l青霉素,50 mg/l鏈霉素,20%(v/v)胎牛血清,15U/ml)比例為1∶9,經(jīng)CF11粉末柱去除白細胞。19℃恒溫培養(yǎng)24小時,吉姆薩染色檢查有無成熟的動合子形成,若有則收集上清,62%(v/v)Nycodenz密度梯度離心分離,25℃,2000rpm離心20分鐘,緩慢吸取中間灰白層動合子,PBS清洗3次,取少許均
14、勻鋪在玻片上,吉姆薩染色檢查純化效果,-80℃凍存。
7、Western-blot。每孔加入50μg蛋白分別為重組蛋白和提純的不同階段瘧原蟲抗原,在含有12%分離膠,5%濃縮膠的SDS-PAGE中分離,一般采用恒壓濃縮膠50v,60分鐘,分離膠80v,100分鐘左右條件。電泳至分離膠下緣,可以結(jié)束電泳。然后電壓60v轉(zhuǎn)膜100分鐘,用5%脫脂奶封閉2小時后加入免疫后小鼠血清(1∶20倍稀釋),4℃搖晃孵育過夜。膜被1×TBST
15、清洗三次每次10分鐘,然后1∶6000倍稀釋的辣根過氧化物酶耦合的二抗,25℃,勻速搖晃1小時,1×TBST洗膜4次每次10分鐘,應(yīng)用HRP-ECL發(fā)光法發(fā)光并成像。
8、間接免疫熒光(IFA)。不同階段的瘧原蟲(裂殖體、配子體,以及動合子)血液混合液1μl均勻平鋪在熒光片上,4%多聚甲醛室溫固定20分鐘然后用10% BSA(PBST配制)37℃溫育30分鐘,PBST沖洗后加入免疫后血清(1:50稀釋)和抗Pbs21陽性對照(
16、1:500稀釋),37℃孵育60分鐘后PBST室溫洗3次每次5分鐘。然后加入FITC標記的羊抗鼠抗體(1∶500稀釋)在37℃恒溫結(jié)合60分鐘,PBST室溫洗3次每次10分鐘,最后DAPI染核,50μl室溫靜置5分鐘后用封片劑封片,熒光顯微鏡下觀察。
9、免疫血清對傳播阻斷效果的評估。動合子轉(zhuǎn)換率比較:在體外,將重組蛋白/PBS免疫的小鼠血清用正常小鼠血清以行1∶10進稀釋。5×106含有Plasmodium berghei
17、ANKA寄生的紅細胞感染小鼠后第4天收集感染小鼠血液10μl置于90μl動合子培養(yǎng)基中。實驗組和對照組19℃培養(yǎng)24小時。用抗Pbs21抗體來固定和標記培養(yǎng)物,在熒光顯微鏡下觀察實驗組和對照組動合子各階段比例。在體內(nèi),用重組蛋白和PBS免疫小鼠,十天后實驗組和對照組分別腹腔注射5×106個Plasmodium berghei ANKA寄生的紅細胞。感染后第3天,30只雌按蚊叮咬用4%多聚甲醛麻醉的小鼠1小時。10天后解剖蚊子比較蚊胃中卵
18、囊數(shù)量。
10、△PSOP26瘧原蟲的構(gòu)建。△PSOP26質(zhì)粒是英國PlasmoGEM機構(gòu)提供,ID為PbGEM-080757 lasmoGEM官網(wǎng):http://plasmogem.sanger.ac.uk/。構(gòu)建成功的質(zhì)粒用NOTⅠ電轉(zhuǎn)染儀轉(zhuǎn)到純度70%~80%的裂殖體中,將150μl紅細胞混合液通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi),經(jīng)過一天的紅內(nèi)期循環(huán)后給予含有五氟尿嘧啶的飲用水連續(xù)三天進行陽性篩選。眼球取血紅細胞感染率達3%左右小
19、鼠5只用PCR進行基因型鑒定。然后選擇陽性瘧原蟲,用生理鹽水稀釋至1ml含有5個瘧原蟲,每只小鼠尾靜脈注射100μl,PCR鑒定從而獲取基因型一致瘧原蟲。
11、△PSOP26與野生型(WT)瘧原蟲基因功能比較。BALB/c(6~8周齡,雌性),隨機分為實驗組對照組,各6只,分別感染5×106個基因敲除型和野生型瘧原蟲。感染率和生存率比較:感后第3天吉姆薩染色開始計數(shù)感染率,雌雄配子體比例,數(shù)量。在體外比較動合子不同階段數(shù)量及
20、配子體出絲情況:取10μl血液置于90μ l動合子培養(yǎng)液中,瘧原蟲在19℃恒溫培養(yǎng)24小時后,用抗Pbs21和羊抗鼠IgG(FITC標記)混合物,用熒光顯微鏡下觀察動合子數(shù)量的差異。同時取小鼠尾靜脈10μl血液加入到90μl動合子培養(yǎng)基中,25℃恒溫培養(yǎng)15分鐘,并在10分鐘內(nèi)完成配子出絲數(shù)的計數(shù)。在體內(nèi)蚊胃內(nèi)卵囊數(shù)量比較:用△PSOP26和WT瘧原蟲感染小鼠分別為實驗組和對照組,感染后第3天,麻醉的感染小鼠并喂養(yǎng)30只按蚊1小時。24
21、小時后取蚊子血液熒光片觀察動合子形成各階段的數(shù)量比較,十天后解剖蚊子來計算蚊胃中卵囊數(shù)量。實驗結(jié)果采用T-text檢驗進行統(tǒng)計分析。
12、統(tǒng)計分析。應(yīng)用GraphPad Prism6.0和SPSS version17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計, P<0.05表示差異有顯著統(tǒng)計學意義。
結(jié)果:1、成功克隆并表達和純化PSOP26。我們成功構(gòu)建pET32a(+)-PSOP26,并轉(zhuǎn)化到Escherichia co
22、li表達菌株BL-21,大量重組蛋白用Western blot電泳分析正確后,His-tag鎳氨三乙酸瓊脂糖柱純化重組蛋白。最后可使得重組蛋白濃度到達0.6mg/ml。
2、免疫血清的免疫原性評價。跟對照組比較,三次免疫后的血清抗體均有強免疫應(yīng)答,且有明顯的區(qū)別。
3、rPSOP26表達位置確定。Western blot:純化后的rPSOP26得到的抗血清可與純化后的動合子特異性結(jié)合。IFA:實驗組在熒光顯微鏡下可見
23、帶有綠色熒光標記的動合子,與陽性對照組一致。
4、動合子形成各階段轉(zhuǎn)換率及卵囊數(shù)量。體外:實驗組跟對照組相比較,動合子階段的macrogamete、round、retort、數(shù)量無明顯變化但動合子轉(zhuǎn)換率降低顯著。體內(nèi):rPSOP26免疫后的小鼠被蚊子叮咬,十天后解剖蚊胃,實驗組中卵囊數(shù)是對照組的一半。
5、△PSOP26型瘧原蟲蟲株制備。從英國PlasmoGEM獲得的質(zhì)粒,通過電轉(zhuǎn)儀輸入到瘧原蟲裂殖體內(nèi),通過乙胺嘧啶
24、陽性選擇出耐藥功能的瘧原蟲后,利用PCR鑒定并得到了基因敲除型的瘧原蟲株△PSOP26。
6、△PSOP26型瘧原蟲與WT瘧原蟲基因功能的比較。△PSOP26與WT相比,瘧原蟲紅細胞感染率及生存期無差別。配子體數(shù)量無顯著變化,雄雌配子體比例有減少的趨勢但無統(tǒng)計學意義。動合子體內(nèi)外的轉(zhuǎn)換率均分別下降55%和60%,配子體出絲數(shù)無明顯統(tǒng)計學意義,蚊子胃中的卵囊數(shù)量急劇減少降低了200倍。
結(jié)論:
1、正確構(gòu)建,
25、純化和表達PSOP26。
2、rPSOP26免疫小鼠后的免疫血清具有優(yōu)秀的免疫原性和高效的抗原性。
3、rPSOP26主要表達于動合子表面。
4、rPSOP26的免疫血清可以抑制瘧原蟲有性階段的動合子形成并減少蚊胃卵囊數(shù)量。
5、成功篩選△PSOP26型瘧原蟲蟲株。
6、△PSOP26與WT比較,小鼠的紅細胞感染率和生存率無根本差別;雄雌配子體比例和總配子體數(shù)量無明顯差別。實驗組的動合子
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