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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
TBC1D3又稱PRC17(前列腺癌基因17),是人科特有的癌基因,高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞,如前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌和骨髓增生異常綜合征等。TBC1D3的表達(dá)可使正常成纖維細(xì)胞NIH3T3發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤,亦可延遲EGFR和IRS-1的降解來(lái)增強(qiáng)GFs信號(hào),導(dǎo)致細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。GFs信號(hào)負(fù)反饋調(diào)節(jié)TBC1D3的穩(wěn)定性,在E3泛素連接酶CUL7的介導(dǎo)下泛素化和降解TBC1D3,使得TBC1D3的蛋白水平
2、維持動(dòng)態(tài)平衡。鈣調(diào)蛋白(CaM)參與眾多蛋白的穩(wěn)定性調(diào)節(jié),如雌激素受體α(ER-α)和TRE17/USP6等,我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示CaM通過(guò)抑制TBC1D3的降解提高其穩(wěn)定性。因此,探討CaM調(diào)節(jié)TBC1D3穩(wěn)定性的機(jī)制,將有助于闡明CaM和TBC1D3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,為腫瘤的診斷和防治提供新線索。
方法:
1.為了研究CaM對(duì)TBC1D3降解的調(diào)節(jié)作用,我們轉(zhuǎn)染GST-CaM使CaM高表達(dá)或使用CaM抑制劑W7
3、抑制內(nèi)源性CaM功能,通過(guò)Western blot和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分別觀察MCF-7和BT-549細(xì)胞內(nèi)CaM對(duì)TBC1D3降解和泛素化的調(diào)節(jié)作用。通過(guò)抽提細(xì)胞漿、細(xì)胞核蛋白,觀察TBC1D3降解的亞細(xì)胞部位及CaM的調(diào)節(jié)作用。
2.為了探討CaM抑制TBC1D3降解的機(jī)制是否通過(guò)相互作用,以GST載體為對(duì)照,將GST-CaM和Flag-TBC1D3復(fù)合轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,用抗GST抗體進(jìn)行免疫共沉淀,檢測(cè)CaM與TBC1D3
4、之間的相互作用;以Flag載體為對(duì)照,將Flag-TBC1D3和GST-CaM復(fù)合轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,用抗Flag抗體進(jìn)行免疫共沉淀,反向檢測(cè)TBC1D3與CaM之間的相互作用;使用Ca2+螯合劑EGTA處理,通過(guò)免疫共沉淀分別觀察MCF-7和BT-549細(xì)胞內(nèi)CaM與TBC1D3的相互作用;over-lap PCR構(gòu)建TBC1D3內(nèi)在缺失突變體Flag-TBC1D3(△157-171)和Flag-TBC1D3(△303-312),以F
5、lag為對(duì)照,分別將GST-CaM和Flag-TBC1D3及其突變體復(fù)合轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,抗Flag抗體做免疫共沉淀檢測(cè)它們與CaM的相互作用,以分析確定TBC1D3氨基酸序列中與CaM相互作用的功能部位;以GST載體為對(duì)照,F(xiàn)lag-TBC1D3及其突變體與GST-CaM分別復(fù)合轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,抗GST抗體做免疫共沉淀,反向驗(yàn)證TBC1D3氨基酸序列中與CaM相互作用的功能部位。
3.為了分析TBC1D3內(nèi)與CaM
6、結(jié)合部位的功能,用over-lap PCR構(gòu)建TBC1D3內(nèi)點(diǎn)突變體Flag-TBC1D3(Y163A-T165A)和Flag-TBC1D3(K166R)。分別轉(zhuǎn)染Flag-TBC1D3、Flag-TBC1D3(△157-171)及點(diǎn)突變體,通過(guò)Western Blot和CO-IP檢測(cè)TBC1D3及點(diǎn)突變體的降解水平和泛素化水平;以Flag為對(duì)照,將Flag-TBC1D3及點(diǎn)突變體分別和GST-CaM復(fù)合轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,抗Flag抗
7、體做免疫共沉淀檢測(cè)它們與CaM的相互作用。
4.為了檢測(cè)TBC1D3的穩(wěn)定性對(duì)細(xì)胞遷移的作用,以Flag空載體為對(duì)照,與Flag-TBC1D3分別轉(zhuǎn)染MCF-7和BT-549細(xì)胞,進(jìn)行劃痕和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。為了探討TBC1D3影響細(xì)胞遷移的機(jī)制,F(xiàn)lag空載體和Flag-TBC1D3分別轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,無(wú)血清饑餓24h后,明膠酶譜法檢測(cè)培養(yǎng)液內(nèi)MMP-9活性;實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot分別檢測(cè)
8、細(xì)胞裂解物內(nèi)MMP-9的mRNA和蛋白水平。復(fù)合轉(zhuǎn)染GST-CaM,觀察CaM對(duì)TBC1D3穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)作用對(duì)細(xì)胞遷移、MMP-9活性和蛋白水平的影響。
結(jié)果:
1.Western blot結(jié)果表明10%FCS可誘導(dǎo)TBC1D3降解,復(fù)合轉(zhuǎn)染CaM并高表達(dá)時(shí),10%FCS誘導(dǎo)的TBC1D3降解受到明顯抑制,說(shuō)明CaM能夠抑制TBC1D3的降解;使用W7抑制內(nèi)源性CaM功能后,TBC1D3的降解趨勢(shì)更加明顯,說(shuō)明內(nèi)源性
9、CaM在TBC1D3降解中的抑制作用;免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示10%FCS可有效誘導(dǎo)TBC1D3的泛素化,CaM的表達(dá)可大大降低TBC1D3的泛素化水平,說(shuō)明CaM可以降低TBC1D3的泛素化水平;細(xì)胞漿、細(xì)胞核蛋白抽提實(shí)驗(yàn)顯示在MCF-7細(xì)胞中,10%FCS刺激誘導(dǎo)TBC1D3降解既發(fā)生于細(xì)胞漿、也發(fā)生于細(xì)胞核且細(xì)胞核內(nèi)降解趨勢(shì)更加明顯;復(fù)合轉(zhuǎn)染CaM并高表達(dá)時(shí),TBC1D3細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)降解受到明顯的抑制,均大大減少。在BT-549細(xì)胞
10、中,10%FCS刺激誘導(dǎo)的TBC1D3降解在細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)均被檢測(cè)到且細(xì)胞漿內(nèi)降解趨勢(shì)更加明顯;復(fù)合轉(zhuǎn)染CaM并高表達(dá)時(shí),TBC1D3細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)降解均受到明顯的抑制。
2.用抗GST抗體進(jìn)行免疫共沉淀,GST對(duì)照組無(wú)TBC1D3結(jié)合條帶,GST-CaM組檢測(cè)到TBC1D3結(jié)合條帶,說(shuō)明TBC1D3與CaM存在相互作用;以抗Flag抗體做反向免疫共沉淀,F(xiàn)lag對(duì)照組無(wú)CaM結(jié)合條帶,F(xiàn)lag-TBC1D3組檢測(cè)到CaM
11、結(jié)合條帶,說(shuō)明CaM與TBC1D3存在相互作用;使用EGTA螯合Ca2+后,以抗Flag抗體或抗GST抗體做免疫共沉淀,均未檢測(cè)到TBC1D3與CaM的相互作用,提示CaM與TBC1D3的相互作用依賴于Ca2+環(huán)境。Over-lap PCR構(gòu)建的TBC1D3缺失突變體Flag-TBC1D3(△157-171)和Flag-TBC1D3(△303-312),經(jīng)Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切和測(cè)序鑒定,序列正確符合預(yù)期。以抗Flag抗體或抗GS
12、T抗體做免疫共沉淀,結(jié)果均顯示157位-171位氨基酸缺失后TBC1D3不能與CaM結(jié)合,提示TBC1D3蛋白序列上與CaM相互作用的部位可能在N端的157到171位氨基酸之間。
3.Over-lap PCR構(gòu)建的TBC1D3點(diǎn)突變體Flag-TBC1D3(Y163A-T165A)和Flag-TBC1D3(K166R),經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切和測(cè)序鑒定,序列正確符合預(yù)期。Western blot結(jié)果顯示10%FCS可誘導(dǎo)
13、Flag-TBC1D3(Y163A-T165A)降解,而Flag-TBC1D3(△157-171)和Flag-TBC1D3(K166R)無(wú)明顯降解;以抗Flag抗體做免疫共沉淀檢測(cè)泛素水平,結(jié)果顯示Flag-TBC1D3(Y163A-T165A)與Flag-TBC1D3均檢測(cè)到明顯泛素化,F(xiàn)lag-TBC1D3(K166R)泛素水平大大降低。以抗Flag抗體做免疫共沉淀,結(jié)果顯示TBC1D3和TBC1D3(K166R)與CaM存在相互作
14、用,F(xiàn)lag對(duì)照和TBC1D3(Y163A-T165A)無(wú)CaM結(jié)合條帶,提示CaM抑制TBC1D3的降解是通過(guò)與TBC1D3相互作用抑制K166的泛素化。
4.細(xì)胞劃痕和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Flag-TBC1D3的MCF-7和BT-549細(xì)胞遷移能力明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染Flag空載體;實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示TBC1D3可上調(diào)MMP-9mRNA水平,Western blot檢測(cè)顯示TBC1D3可上調(diào)MMP-9蛋
15、白水平,明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示TBC1D3可增強(qiáng)MMP-9活性,提示TBC1D3促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移可能是通過(guò)上調(diào)MMP-9的蛋白和活性水平。復(fù)合轉(zhuǎn)染CaM時(shí),TBC1D3上調(diào)的MMP-9的蛋白和活性水平以及誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移均被增強(qiáng)。
結(jié)論:
1.CaM增強(qiáng)人乳腺癌細(xì)胞漿、細(xì)胞核TBC1D3蛋白的穩(wěn)定性。
2.Ca2+/CaM與TBC1D3的N端157位-171位氨基酸序列相互作用。
3.泛素化位點(diǎn)K166
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