鈣調蛋白結合蛋白及其磷酸化對乳腺癌細胞運動能力的調節(jié)作用.pdf

1、乳腺癌是全球女性癌變診斷率最高的癌癥之一，由于其高轉移活性以及轉移后高達90％的死亡率而備受人們關注。無序生長和高運動活性是轉移性乳腺癌細胞的重要特征，這兩個過程都涉及到細胞肌動蛋白骨架在各種肌動蛋白結合蛋白調節(jié)下的解聚與重排。鈣調蛋白結合蛋白(Caldesmon，CaD)是存在于幾乎所有脊椎動物細胞中的肌動蛋白結合蛋白，有由同一基因衍生的兩種亞型：平滑肌型(h-caldesmon，h-CaD)和普遍存在的非肌型輕鏈CaD(1-cald

2、esmon，1-CaD)。
　　 體外研究表明，1-CaD通過與肌動蛋白結合，穩(wěn)定肌動蛋白纖維結構，抑制其解聚。因此，人們都普遍認為1-CaD在細胞內的基本功能為減弱細胞骨架調整，抑制細胞運動活性。事實上，在眾多非轉移性癌細胞中，1-CaD的表達量顯著下調，但在一些高遷移活性的轉移性癌細胞中，1-CaD不僅表達量明顯增加，胞內磷酸化程度也大幅度提高，抑制細胞運動活性顯然不能完全概括1-CaD在轉移性癌細胞中的功能。為揭示1-Ca

3、D對轉移性乳腺癌細胞遷移運動活性的影響及其調節(jié)機制，并為進一步認識乳腺癌本質提供了新的思路，本研究以人源轉移性乳腺癌細胞MD MB-231和非轉移性乳腺癌細胞MCF-7作為實驗載體，首先，通過構建體外肌動蛋白聚合陣列驗證了1-CaD及其磷酸化對肌動蛋白聚合過程的影響；其次，通過基因沉默和外源基因高表達相結合的方法，探索1-CaD及其磷酸化對轉移性乳腺癌細胞遷移運動活性的可能調節(jié)機制；最后，我們將模擬1-CaD磷酸化位點封閉的合成多肽導入

4、MD MB-231細胞內并通過裸鼠腫瘤形成模型，進一步檢測1-CaD及其磷酸化對轉移性乳腺癌細胞遷移運動活性以及在體腫瘤形成能力的影響。我們的主要研究內容包括：
　　 ①體外蛋白層次上，利用熒光標記的G-actin，在F-actin緩沖體系中，不同時間位點分別加入1-CaD的C-端功能片段H32K及其磷酸化形式，檢測G-actin聚合形成F-actin的動力學過程。結果顯示，H32K能夠迅速與肌動蛋白結合，并對肌動蛋白的聚合過程

5、有雙重調節(jié)作用：在肌動蛋白聚合初期，H32K將抑制成熟肌動蛋白纖維的形成；在肌動蛋白聚合過程中，H32K將促進成熟肌動蛋白纖維的形成。磷酸化H32K失去了對肌動蛋白聚合初期的抑制作用，對肌動蛋白聚合無顯著影響。
　　 ②細胞層次上，western-blotting檢測MDA MB-231、MCF-7以及正常人源上皮細胞HMEC的胞內1-CaD表達量及其磷酸化程度。結果顯示，1-CaD在MDAMB-231細胞中獲得了顯著高表達，其

6、表達水平與HMEC細胞相當，而MCF-7的1-CaD表達量顯著低于MDA MB-231細胞。除此之外，MDA MB-231胞內1-CaD磷酸化水平顯著高于HMEC細胞。1-CaD在轉移性乳腺癌細胞中的高表達以及顯著高于正常細胞的磷酸化水平，可能是轉移性乳腺癌細胞高侵襲表象的一個重要因素。
　　 ③利用siRNA慢病毒載體感染MDA MB-231細胞，抑制胞內1-CaD表達，首先，通過western-blotting，檢測1-Ca

7、D基因沉默的效率；其次，通過rhodaminephalloidin染色細胞骨架，考察1-CaD表達沉默對細胞骨架結構的影響，再次，通過Transwell檢測細胞的遷移運動能力，最后通過Traction force、細胞粘附陣列進一步檢測細胞遷移過程中的細胞基底牽張力與基底粘附能力。結果顯示，1-CaD表達沉默將導致細胞失去完整的細胞骨架結構，胞內應力纖維結構消失，細胞的遷移運動活性顯著下降，細胞遷移過程中的細胞基底牽張力與粘附能力亦顯著

8、下調。
　　 ④利用外源野生型wtCaD以及模擬PAK和ERK磷酸化位點封閉的1-CaD突變株A1234和模擬PAK和ERK位點完全磷酸化的突變株D1234作為“分子探針”來干擾或阻斷胞內1-CaD磷酸化進程。檢測外源1-CaD質粒的表達效率，考察高表達外源1-CaD細胞的骨架結構，檢測細胞的遷移運動活性以及細胞基底牽張力與粘附能力。結果顯示，wtCaD與A1234轉染的細胞，細胞骨架顯著增強，細胞基底牽張力與粘附能力明顯上調，

9、但細胞整體遷移運動能力明顯受到抑制；D1234對細胞骨架結構無顯著影響，但明顯抑制了轉移性乳腺癌細胞的遷移運動能力，對非轉移性乳腺癌細胞的影響不顯著。
　　 ⑤合成模擬1-CaD在PAK與ERK磷酸化位點封閉的多肽，并導入MDA MB-231細胞內，檢測細胞骨架結構變化，考察細胞的增殖和遷移運動活性，通過裸鼠腫瘤形成模型，檢測多肽導入后的MDA MB-231在體腫瘤形成能力。結果顯示，合成多肽能夠顯著抑制MDA MB-231細胞

10、的增殖和運動活性以及在體的腫瘤形成能力。
　　 綜合以上結論我們推測，1-CaD是轉移性乳腺癌細胞骨架結構的重要組成部分和調節(jié)因子，并能通過介導細胞骨架結構調整影響乳腺癌細胞遷移運動活性。1-CaD在轉移性乳腺癌細胞內的高表達和高效的磷酸化-去磷酸化循環(huán)可能是維持轉移性乳腺癌細胞高遷移活性的關鍵因素，抑制1-CaD在胞內的表達或干擾其胞內磷酸化循環(huán)都將顯著抑制轉移性乳腺癌細胞的遷移運動活性。模擬非磷酸化1-CaD的合成多肽對轉移