PTPN18對HER2蛋白的磷酸化水平和泛素化水平的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、細(xì)胞對于生長因子的不正常反應(yīng)會造成細(xì)胞的異常生長，這在人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。HER2目前引起了廣泛的關(guān)注，因?yàn)槠涓弑磉_(dá)預(yù)示著乳腺癌，卵巢癌，胃癌和其它癌癥等的預(yù)后不良。HER2通常被看成是一個(gè)孤兒受體，當(dāng)受到表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）刺激時(shí)，HER2作為EGFR家族的一個(gè)成員，與EGFR家族的其它成員形成同源或異源二聚體，進(jìn)而激活下游的細(xì)胞信號通路，影響細(xì)胞功能。HER2的C末端酪

2、氨酸殘基的磷酸化是由蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTPs）兩種酶精確協(xié)同控制的。其中的蛋白酪氨酸磷酸酶在細(xì)胞信號通路中作為一個(gè)重要的角色，調(diào)控細(xì)胞的功能。在不同的刺激條件下，蛋白酪氨酸磷酸酶的調(diào)節(jié)影響了細(xì)胞生長和增殖，細(xì)胞周期，細(xì)胞骨架等細(xì)胞功能。最近的研究發(fā)現(xiàn)PTP-MEG2，PTPN12，PTPN13和PT

3、PN18，這些蛋白酪氨酸磷酸酶在特定的細(xì)胞環(huán)境中參與HER2相關(guān)的信號通路;然而，由這些磷酸酶調(diào)控HER2的酪氨酸磷酸化的機(jī)制從未詳細(xì)探討。其中，PTPN18，也叫BDP1，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的針對HER2蛋白的酪氨酸磷酸酶;同時(shí)PTPN18的N端是蛋白酪氨酸磷酸酶催化結(jié)構(gòu)區(qū)域，C端調(diào)控區(qū)域富集脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)，因此屬于酪氨酸磷酸酶PEST家族。有趣的是，PTPN18只對HER2進(jìn)行去磷酸化的作用，而不

4、對EGFR或IGF1R的磷酸化的酪氨酸進(jìn)行去磷酸化。以前的研究發(fā)現(xiàn)PTPN18可以調(diào)控HER2的磷酸化水平，然而這其中如何調(diào)控HER2信號通路的分子機(jī)制還不清楚。本論文研究表明PTPN18催化結(jié)構(gòu)域水解底物具有嚴(yán)格的底物特異性，并且發(fā)現(xiàn)其C端調(diào)控結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)HER2泛素化的新功能。
　　研究方法：
　　1)體外蛋白表達(dá)純化
　　通過大腸桿菌-BL21原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)帶有GST和HIS標(biāo)簽的不同長度的PTPN18蛋白和部

5、分蛋白酪氨酸磷酸酶家族的蛋白;通過親和層析和離子交換的方法獲得純度高達(dá)95％以上的目的蛋白。
　　2)體外酶活測定
　　以小分子化合物pNPP和帶有磷酸化的酪氨酸的短肽為底物，檢測PTPN18的催化結(jié)構(gòu)域?qū)@兩類底物的催化活力。利用點(diǎn)終止法通過酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)，獲得酶活常數(shù)Kcat和Km。同時(shí)體外檢測PTPN18催化結(jié)構(gòu)域?qū)?xì)胞內(nèi)生理底物—HER2的磷酸酶活力。
　　3)晶體生長及晶體結(jié)構(gòu)解析
　　將純化的PTPN

6、18的催化結(jié)構(gòu)域陷阱突變蛋白分別與含有HER2的pY1112，pY1196，pY1248這3個(gè)酪氨酸位點(diǎn)磷酸化的磷酸多肽混合，懸滴法共結(jié)晶，25℃靜置3天后收集單晶，并通過X-射線衍射獲得衍射數(shù)據(jù)，解析PTPN18的催化結(jié)構(gòu)域蛋白與HER2磷酸短肽復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。
　　4)免疫共沉淀(CO-IP)技術(shù)
　　在哺乳細(xì)胞HepG2細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中，過表達(dá)或干擾PTPN18以及β-TRCP后，通過免疫共沉淀的方法檢測PTP

7、N18與其它蛋白的相互作用以及PTPN18對HER2蛋白泛素化的影響。
　　5) GST-pulldown實(shí)驗(yàn)
　　將體外純化的帶GST標(biāo)簽的不同截短的PTPN18蛋白與細(xì)胞內(nèi)HER2蛋白進(jìn)行共孵育，檢測不同截短的PTPN18蛋白對HER2蛋白的結(jié)合能力。
　　6) MTT方法
　　在HepG2細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)PTPN18不同的突變質(zhì)?；蚋蓴_PTPN18，通過加入MTT觀察24-72小時(shí)的細(xì)胞增殖狀態(tài)。活細(xì)胞線粒體中

8、的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死的細(xì)胞沒有這種功能。在酶聯(lián)免疫檢測儀(OD570 nm)測定其光吸收值，間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，從而反映PTPN18對細(xì)胞增殖的影響。
　　7) Transwell方法
　　在HepG2細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)PTPN18不同的突變質(zhì)粒，加EGF刺激后，利用結(jié)晶紫染色，檢測不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)各個(gè)突變體對該細(xì)胞的侵襲的能力。
　　8)免疫熒光

9、染色
　　在HepG2細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)PTPN18的野生型和D197A突變體，用單克隆抗體RPN12(蛋白酶體途徑的標(biāo)記物)和Lamp1（溶酶體途徑的標(biāo)記物）檢測PTPN18對HER2蛋白的分布、降解的調(diào)控作用。
　　9) Western Blot
　　在細(xì)胞系中對PTPN18進(jìn)行干擾后，加EGF刺激檢測在不同時(shí)間點(diǎn)HER2和EGFR的C末端不同的酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化水平。
　　在細(xì)胞系中過表達(dá)PTPN18野生型及不同

10、的突變型，加EGF刺激后檢測PTPN18對HER2的C末端不同的酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化水平，以及對HER2相關(guān)信號通路（增殖，遷移和HER2蛋白降解）的影響。
　　在細(xì)胞系中過表達(dá)HER2的C末端質(zhì)粒，加EGF刺激后IP純化HER2C末端蛋白，與純化的PTPN18的催化結(jié)構(gòu)域蛋白進(jìn)行體外酶活分析，利用Western檢測PTPN18對HER2的C末端不同的酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化水平。
　　在細(xì)胞系過表達(dá)PTPN18野生型及不同的截短及

11、失活突變后，檢測PTPN18對HER2蛋白的結(jié)合能力。
　　在多種乳腺癌細(xì)胞系或人乳腺癌組織樣品中，檢測PTPN18蛋白與HER2蛋白的表達(dá)量以及相關(guān)性。
　　10)統(tǒng)計(jì)分析
　　所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，應(yīng)用Image J分析軟件對Western Blot進(jìn)行蛋白定量分析;應(yīng)用Graphad Prism5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行酶活數(shù)據(jù)的分析;所有數(shù)據(jù)均采用±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.

12、01用**或＃＃進(jìn)行標(biāo)記，以P＜0.05用*或＃進(jìn)行標(biāo)記。
　　結(jié)果：
　　我們在蛋白分子水平和細(xì)胞水平研究并闡明了PTPN18的N端催化結(jié)構(gòu)域和C端調(diào)控結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涞孜颒ER2的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，PTPN18通過N端磷酸酶催化結(jié)構(gòu)域?qū)ER2的去磷酸化以及C端PEST結(jié)構(gòu)域?qū)ER2的泛素化進(jìn)行精確調(diào)控，從而調(diào)控HER2介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號通路。具體結(jié)果如下:
　　1)我們對PTPN18和HER2進(jìn)行體外酶活性的測定和晶

13、體結(jié)構(gòu)的解析闡明了PTPN18對HER2的C末端不同的磷酸化位點(diǎn)具有選擇性。我們解析了PTPN18催化結(jié)構(gòu)域陷阱突變與磷酸多肽的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（PTPN18與含有HER2的pY1112，pY1196，pY1248磷酸化位點(diǎn)的3個(gè)磷酸多肽的晶體復(fù)合物），并發(fā)現(xiàn)PTPN18中的催化區(qū)結(jié)構(gòu)域?qū)ER2的C末端的磷酸化的酪氨酸去磷酸化的選擇特異性及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。PTPN18與HER2的pY1112，pY1196，pY1248這3個(gè)磷酸多肽的晶體結(jié)構(gòu)

14、復(fù)合物同時(shí)顯示了以下兩種特殊的結(jié)構(gòu)特征:(1) HER2短肽的pY+1位氨基酸殘基與PTPN18具有疏水相互作用，可以選擇性調(diào)節(jié)兩者之間的作用。(2)PTPN18的第198位的精氨酸側(cè)鏈的可塑性，其側(cè)鏈對兩種短肽底物的識別具有重要意義。
　　2)我們研究發(fā)現(xiàn)PTPN18對HER2的不同磷酸化位點(diǎn)的特異性作用抑制了HER2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移。在細(xì)胞系中，過表達(dá)PTPN18野生型及不同突變型，發(fā)現(xiàn)PTPN18特異性去磷酸化HER

15、2的C端第1196位和1248位酪氨酸的關(guān)鍵氨基酸(hot spot);闡明了PTPN18降低HER2的C末端的第1196位和第1248位的酪氨酸磷酸化水平，從而對HER2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和侵襲具有負(fù)向調(diào)控作用的分子機(jī)制。
　　3)我們研究發(fā)現(xiàn)PTPN18的C端PEST調(diào)控結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)HER2泛素化的新功能。雖然PTPN18的催化結(jié)構(gòu)域通過去磷酸化HER2的C末端第1112位酪氨酸的磷酸化，而減少與E3泛素連接酶c-Cbl的結(jié)合，從而

16、延遲了HER2蛋白的溶酶體降解途徑，但是PTPN18的PEST結(jié)構(gòu)域可以促進(jìn)泛素蛋白K48介導(dǎo)的HER2蛋白的泛素化進(jìn)而引起蛋白酶體的降級途徑。其中我們發(fā)現(xiàn)，PTPN18的C端第419-423位氨基酸序列中S419/S423磷酸化后與β-Trcp結(jié)合，通過“AKT-PTPN18/β-Trcp-HER2”泛素化途徑對HER2蛋白有降快速解作用。PTPN18切換HER2的泛素化和降解的路線，這既需要PTPN18 N端的催化結(jié)構(gòu)域和C端的PE