七氟醚麻醉對腦內(nèi)ERK1-2、CREB和PKCγ磷酸化水平的影響.pdf

1、全麻問世并廣泛應用于臨床已有160 余年。然而，全麻藥物是如何引起機體意識喪失、遺忘、制動等全麻效應的？全麻藥物的作用靶點是什么？至今仍是未解之謎，對全麻藥物本質(zhì)及作用機理認識的局限，極大制約了全身麻醉安全、可控的臨床應用及新型麻醉藥物的研發(fā)。 應該肯定的一點是：全麻藥物是作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)而產(chǎn)生意識喪失、遺忘、制動等麻醉效應的。一般認為，全麻藥物是作用于前額皮層、頂皮層、海馬等區(qū)域產(chǎn)生鎮(zhèn)靜和遺忘作用，而脊髓和低位腦干在臨床全麻

2、藥物的制動效應中起了主導作用?？梢?，全麻藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用是多方位、多靶點的，單一的膜脂溶性、離子通道、受體及基因等學說無法完全解釋全麻(尤其是吸入麻醉)的復雜效應。 既往全麻機制研究中已發(fā)現(xiàn)大量受體、分子與全麻效應可能相關，但很難將這些分散的結果有機地聯(lián)系起來。細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)具有變化迅速，能將大量信號有機串聯(lián)和整合的特點。 本研究中我們擬以目前臨床常用的吸入性麻醉劑七氟醚為例，從麻醉時腦內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分子活化水平

3、的變化入手，為探討吸入麻醉的中樞機制尋找突破口。 目的 觀察七氟醚麻醉－蘇醒過程中腦內(nèi)ERK1/2、CREB 和PKCγ磷酸化水平的變化，以了解這些信號轉(zhuǎn)導分子在全麻機理中的可能作用，為探索吸入麻醉藥的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用靶位和相關信號通路提供資料。 方法 第一部分 1. 小鼠七氟醚麻醉－蘇醒過程中腦內(nèi)磷酸化ERK1/2 的表達變化BALB/c 小鼠60 只，平均分為5 組：正常對照組(Con)、七氟

4、醚麻醉5min組(Sevo-1)、麻醉1h 組(Sevo-2)、麻醉1h 停藥2min 組(E-1)和麻醉1h 停藥1h組(E-2)。各組動物在相應時間點脫臼處死，取腦制樣或經(jīng)灌注固定后取腦切片，行Western blotting 或免疫組織化學染色，觀察七氟醚麻醉－蘇醒過程不同腦區(qū)磷酸化ERK1/2 (pERK1/2)水平的變化。 2. 七氟醚麻醉下小鼠的血氣電解質(zhì)狀況雄性BALB/c 小鼠12 只，隨機分為2 組：對照組(C

5、on)和七氟醚麻醉1h組(Sevo-1h)，相應時間點開胸心臟采集動脈血，了解麻醉過程中的血氣及電解質(zhì)情況。 3. MEK1/2 拮抗劑SL327 對七氟醚麻醉行為的影響雄性BALB/c小鼠18 只，隨機分為3 組：Con組；DMSO組：麻醉前1 小時腹腔注射25％DMSO，6 ml·kg-1；SL327 組：麻醉前1 小時腹腔注射溶解于25％DMSO的SL327，30 mg·kg-1。各組小鼠以4％七氟醚誘導，記錄翻正反射消失

6、時間，然后以1MAC七氟醚維持麻醉30min后，停止麻醉，高流量氧氣洗脫，觀察夾尾反射恢復時間。待夾尾反射恢復后，動物斷頭，取腦制樣，Western blotting檢測腦內(nèi)pERK1/2 表達水平。 第二部分 小鼠七氟醚麻醉－蘇醒過程不同腦區(qū)磷酸化CREB 的表達變化雄性BALB/c 小鼠30 只，隨機分為5 組：Con 組、Sevo-1 組、Sevo-2組、E-1 組和E-2 組。處理措施同實驗1.1。在相應時間點斷

7、頭，取感覺皮質(zhì)、海馬、腦干行Western blotting 測定腦內(nèi)pCREB 表達情況。 第三部分 1. 磷酸化PKCγ在正常小鼠腦內(nèi)的免疫組織化學定位雄性BALB/c 小鼠8 只，脫臼處死，灌流取腦，免疫組織化學染色，觀察pPKCγ陽性反應產(chǎn)物在腦內(nèi)的分布。 2. 小鼠七氟醚麻醉－蘇醒過程中腦內(nèi)磷酸化PKCγ的表達變化雄性BALB/c 小鼠48 只，隨機分為4 組：對照組(Con)、七氟醚麻醉5min組(S

8、evo-1)、七氟醚麻醉1h 組(Sevo-2)和麻醉1h 后停藥1h 組(E-1h)。在相應時間點斷頭取樣行Western blotting，灌注取腦切片行免疫組織化學染色，以觀察七氟醚麻醉－蘇醒過程中小鼠腦內(nèi)pPKCγ的表達變化。 結果 第一部分 1. 小鼠七氟醚麻醉－蘇醒過程中腦內(nèi)磷酸化ERK1/2 的表達變化Western blotting 結果：與Con 組相比，麻醉后各組動物感覺皮質(zhì)、海馬pERK 表

9、達水平下降，蘇醒后回升至對照組水平(E-1, E-2)，而腦干在麻醉后pERK 表達水平上升，且蘇醒后仍未降至對照組水平。免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)外側網(wǎng)狀核、孤束核、EW 核、臂旁外側核背側亞核(LPBD)、視上核(SO)、下丘腦室旁核(PVN)、杏仁中央核和終紋床核在Con 組弱表達，Sevo-1、Sevo-2及E-1 三組表達顯著增強(P<0.05)，而在E-2 組表達減弱，除LPBD、SO、PVN 外在其余各核團均恢復至對照組水平。而

10、室周灰質(zhì)腹外側部、丘腦室旁核、弓狀核則表達相反：Con 組高表達，Sevo-1，Sevo-2 及E-1 三組陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著減少(P<0.05)，E-2 組恢復至Con 組水平。此外，海馬、邊緣前皮質(zhì)、扣帶回、運動皮質(zhì)、感受皮質(zhì)則表現(xiàn)為Con 組高表達，Sevo-1 組和Sevo-2組低表達，E-1 和E-2 組恢復至對照組水平。 2. 七氟醚麻醉下小鼠的血氣電解質(zhì)狀況1MAC 七氟醚麻醉1h，小鼠血氣及電解質(zhì)情況與對照組相比

11、無改變。 3. MEK1/2 拮抗劑SL327 對七氟醚麻醉行為的影響SL327 組與對照組相比，翻正反射消失時間及夾尾反射恢復時間均縮短，而DMSO 組與Con 組無差異。Western blotting 顯示：SL327 組動物的感覺/運動皮質(zhì)、海馬pERK1/2 表達水平均較對照組顯著降低(P<0.05)，而DMSO組與Con 組無差異。 第二部分 小鼠七氟醚麻醉－蘇醒過程不同腦區(qū)磷酸化CREB 的表達變化

12、各組間感覺皮質(zhì)、海馬、腦干在麻醉－蘇醒過程中pCREB 表達無統(tǒng)計學差異。 第三部分 1. 磷酸化PKCγ在正常小鼠腦內(nèi)的免疫組織化學定位pPKCγ陽性產(chǎn)物主要見于神經(jīng)元的胞漿和突起中，在正常小鼠腦內(nèi)表達廣泛。僅有少量膠質(zhì)細胞被染色，著色淺淡。海馬CA1 區(qū)錐體細胞，小腦的浦肯野細胞，大腦新皮質(zhì)V 層細胞，邊緣前皮質(zhì)、島皮質(zhì)的深層細胞以及前梨皮質(zhì)的顆粒層細胞，外側嗅束核、杏仁基底外側核和杏仁外側核的神經(jīng)元，以及穹窿、錐體

13、束纖維等均有強或較強的pPKCγ表達。吻側丘腦大多數(shù)核團，尾側丘腦的內(nèi)側膝狀體核及外側膝狀體的背側核，腦干耳蝸背側核的表淺部位，三叉神經(jīng)感覺核簇及巨細胞網(wǎng)狀結構神經(jīng)元中均有弱陽性表達。 2. 小鼠七氟醚麻醉－蘇醒過程中腦內(nèi)磷酸化PKCγ的表達變化Western blotting 示海馬pPKCγ表達在對照組低表達，麻醉后表達增強，在E-1h 組回落至Con 組水平。免疫組織化學染色顯示：在Con 組，錐體束和穹窿中pPKCγ呈高

14、水平表達，而Sevo-1 和Sevo-2 組表達顯著減弱，E-1h組恢復至對照組水平。杏仁基底外側核pPKCγ表達則不同：在Con 組低水平表達，而Sevo-1、Sevo-2 和E-1h 組均呈現(xiàn)高水平表達(P<0.05)。 結論 1. 在麻醉－蘇醒過程中，腦內(nèi)某些核團、腦區(qū)其pERK1/2 水平出現(xiàn)與麻醉表象一致的變化。根據(jù)已有知識和資料分析，部分pERK1/2 表達升高的核團如LPBD、PVN 等可能與麻醉造成的應激

15、反應有關；而另一些pERK1/2水平下調(diào)的核團如M、S、Hip 等，可能與麻醉引起意識與感覺認知缺失有關。 七氟醚麻醉－蘇醒過程中，總ERK1/2 表達未發(fā)生改變，主要是ERK 磷酸化水平的上調(diào)或下調(diào)，提示麻醉主要影響ERK 通路的活化水平，而不涉及新的(de novo)蛋白質(zhì)合成。 2. MEK-ERK 通路特異阻斷時，全麻誘導加快，蘇醒迅速，從功能行為學上進一步證實了ERK 可能在全麻不同時程中介導不同效應，其確切機

16、制尚待進一步深入研究。 3. 作為ERK 通路的下游分子之一，pCERB 在七氟醚麻醉－蘇醒過程中各組間表達無差異，提示CREB 通路可能不參與此過程的調(diào)節(jié)或CREB 介導的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄機制在所觀察的時間點尚未激活。 4. 在正常狀態(tài)及麻醉－蘇醒過程中pPKCγ表達變化的觀察顯示，傳導束中的pPKCγ在七氟醚麻醉時磷酸化水平減弱，提示全麻可能抑制了pPKCγ在軸突中的功能，是否進而影響了軸突轉(zhuǎn)運或興奮傳導尚待進一步研究。