低氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦內(nèi)MSK1和Elk-1磷酸化水平及蛋白表達(dá)量的變化.pdf

1、低氧是我們生活中一種常見現(xiàn)象，許多生理病理過程都伴隨著低氧，如新生兒低氧、高原反應(yīng)、心肌梗塞、創(chuàng)傷、缺血、中風(fēng)等。對(duì)大多數(shù)脊椎動(dòng)物來說，充足的供氧是生存的先決條件，而腦由于其耗氧量高，是低氧后最先受損的器官之一。缺血/低氧預(yù)適應(yīng)(Ischemic/hypoxic preconditioning，I/HPC)現(xiàn)象最早由美國(guó)學(xué)者M(jìn)urry等于1986年在心臟上發(fā)現(xiàn)。腦I/HPC則最早由Kitagawa等人于1990年報(bào)道，即事先對(duì)沙鼠給予亞

2、致死性、短暫的腦部缺血刺激后可使神經(jīng)元對(duì)后續(xù)重度缺血產(chǎn)生耐受。關(guān)于I/HPC存在兩種不同的概念：一種是組織器官受到缺血低氧刺激后幾分鐘到數(shù)小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)的早期耐受，稱之為“經(jīng)典或早期I/HPC”；另一種是缺血或低氧刺激后，數(shù)天發(fā)生的晚期耐受，即晚期I/HPC或第二保護(hù)窗口(second window ofprotection)。這兩種I/HPC的產(chǎn)生機(jī)制和存在時(shí)間不同。早期I/HPC一般在誘發(fā)后的2小時(shí)內(nèi)消失，其發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的

3、變化有關(guān)，如蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性的改變；而晚期I/HPC在刺激24-72小時(shí)后產(chǎn)生，其機(jī)制與基因表達(dá)的改變和新蛋白的合成有關(guān)。由腦FHPC引起的組織保護(hù)機(jī)制為臨床防治缺血/低氧性腦損傷提供了新策略。對(duì)腦I/HPC機(jī)制的探討，尤其是對(duì)參與調(diào)節(jié)I/HPC的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究，特別是絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，已成為近年國(guó)內(nèi)外低氧研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前對(duì)M_APK的三條主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERKl/2)

4、、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和蛋白38激酶(p38)在腦FHPC中的作用已有廣泛的研究。但是，對(duì)于MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游重要底物：絲裂原和應(yīng)激激活的蛋白激酶1(mitogen—and stress．a(chǎn)ctivated protein kinasel，MSKl)和Ets樣轉(zhuǎn)錄因子-1(Ets-liketranscription factor，Elk-1)在腦I/HPC發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，MS

5、Kl是ERKl/2和p38兩條通路上的作用底物。MSKl是一些重要的轉(zhuǎn)錄因子，女HcAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)和ATF等的上游激酶，可以使之磷酸化從而引起一些即早基因(IEGs)如c-fos，jun-B和egr-l等的轉(zhuǎn)錄。與MSK1信號(hào)通路略有不同的是，Hk-1是ERK1／2、JNK和p38等三條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用底物。Hk-1是一種轉(zhuǎn)錄因子，激活后也可引起諸如c-fos和egr-1等即早基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因的產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)神經(jīng)

6、元在應(yīng)激性損傷后的保護(hù)、再生、存活及修復(fù)等過程。因此，探討MSK1和Elk-1在腦I／HPC發(fā)生發(fā)展過程中的作用，可進(jìn)一步豐富人們對(duì)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦I／HPC形成中作用的認(rèn)識(shí)。本實(shí)驗(yàn)在室溫18-22℃條件下進(jìn)行，在已建立的自然低氧誘導(dǎo)的“小鼠整體HPC模型”基礎(chǔ)上，將成年健康雄性BALB／c小鼠(12-14周，體重18-22克)隨機(jī)分為正常對(duì)照組(H0)、低氧暴露1次(H1)、重復(fù)性低氧2-4次(低氧預(yù)適應(yīng)早期，H2-H4)，以

7、及重復(fù)性低氧5和6次(4次低氧小鼠恢復(fù)24h后，再進(jìn)行第5、6次低氧刺激，即H5和H6為延遲性低氧預(yù)適應(yīng))等7組。以出現(xiàn)第一次喘式呼吸為低氧結(jié)束的指標(biāo)，記錄低氧耐受時(shí)間。在常氧環(huán)境下至少恢復(fù)30分鐘再進(jìn)行下一次低氧。低氧結(jié)束后，將小鼠處死，取前腦皮層和海馬組織。實(shí)驗(yàn)用蛋白凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western-blot)等生化技術(shù)，并結(jié)合Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)定量觀察了早期和延遲性HPC小鼠大腦皮層和海馬組織內(nèi)MSK

8、1及Elk-1的磷酸化水平和蛋白表達(dá)量的變化。此外，本實(shí)驗(yàn)還應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法從形態(tài)學(xué)上觀察了HPC小鼠大腦皮層和海馬組織內(nèi)MSK1及Elk-1的磷酸化水平的變化及其在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。實(shí)驗(yàn)還應(yīng)用免疫雙標(biāo)的方法確定了低氧刺激后MSK1和Elk-1發(fā)生磷酸化激活的細(xì)胞類型。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過One Way ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(x±S.E.)，p<0.05有顯著意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著低氧次數(shù)

9、的增多，小鼠低氧耐受時(shí)間增加。與只經(jīng)過1次低氧預(yù)處理的H1組(18.0±1.8min，n=6)d、鼠相比，H2(32.8±3.4min，p<0.05，n=6)、H3(36.8±2.5min，p<0.05，11=6)和H4(38.5±1.9min，p<0.05，n=6)組等早期HPC小鼠的低氧耐受時(shí)間明顯增高；而H5(21.5±2.9min，p<0.05，n=6)和H6(27.8±3.9min，p<0.05，n=6)等延遲性HPC組小鼠的

10、低氧耐受時(shí)間雖然沒有H2-H4組延長(zhǎng)的那么明顯，但與H1組比較，仍具有顯著差異。 2定量分析HPC小鼠腦組織內(nèi)MSK1和E1k-1磷酸化水平變化發(fā)現(xiàn)，在HPC早期的形成過程中，隨低氧次數(shù)(H1-H4)或耐受時(shí)間的增加，小鼠海馬和皮層組織內(nèi)Thr645-MSK1(p-Thr645 MSK1)、Ser375-MSK(p-Ser375 MSK1)和Ser383-Elk-1(p-Ser383 Elk-1)磷酸化水平顯著增高(p<0.05

11、，每組n=6)；在延遲性低氧預(yù)適應(yīng)(H5和H6)形成過程中，p-Thr645-MSK1、p-Ser375-MSK-1和p-Ser383 Elk-1水平也顯著升高(p<0.05，n=6)。提示，MSK1和Elk-1的激活可能參與了腦早期和晚期HPC的發(fā)生發(fā)展過程。 3 定量分析HPC小鼠腦組織內(nèi)MSK1及Elk-1蛋白表達(dá)量的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，無論在腦HPC早期形成(H1-H4)，還是在延遲性HPC(H5和H6)發(fā)展過程中，隨低氧次數(shù)或

12、耐受時(shí)間的增加，小鼠海馬和皮層組織內(nèi)MSK1及Elk-1蛋白表達(dá)量均無明顯的改變。提示，MSK1和Elk-1并不以蛋白表達(dá)量改變的形式參與腦HPC的發(fā)生發(fā)展過程。 4 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，重復(fù)性低氧暴露后(H3和H6)，小鼠海馬和大腦皮層組織內(nèi)p-Thr645-MSK1、p-Ser375-MSK和p-Ser383-Elk-1陽性顆粒明顯增加。這一形態(tài)學(xué)結(jié)果進(jìn)一步支持了上述蛋白印跡結(jié)果，即MSK1和Elk-1的磷酸化水平在腦