清腦滴丸對缺血海馬、皮層MARCKS磷酸化及其基因表達動態(tài)變化的影響.pdf

1、腦血管病是中老年人的常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高，腦血管病在大多數(shù)國家死因順位居前三位，幸存者75％以上留有不同程度的后遺癥，當(dāng)前對腦血管的預(yù)防、治療效果雖有一定的提高，但無突破性進展，一個重要原因是對其發(fā)病機理認(rèn)識不清。近20年來，人們從分子生物學(xué)、病理學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)、藥理學(xué)等角度對于腦缺血的發(fā)病機制、病理過程進行研究，認(rèn)為腦缺血損害涉及到自由基損傷、能量耗竭、鈣超載等問題，與興奮性氨基酸、一氧化氮、內(nèi)皮素等關(guān)

2、系密切。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)許多分子介導(dǎo)、參與了腦缺血損害過程，其中對細(xì)胞跨膜信息傳遞的研究認(rèn)識到不僅在神經(jīng)系統(tǒng)乃至整個生命活動中都起著極為基本和重要的作用。許多疾病的發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常都有直接或間接的關(guān)系。 缺血性腦血管病最核心的問題是神經(jīng)細(xì)胞損害引起的神經(jīng)功能障礙，因此，治療缺血性腦血管病的最重要任務(wù)是保護和恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞功能，神經(jīng)保護藥物可以增強神經(jīng)細(xì)胞對缺血的耐受性而最終促進功能恢復(fù)，研制臨床行之有效的神經(jīng)保

3、護藥物仍是當(dāng)今神經(jīng)學(xué)科領(lǐng)域的重點。許多神經(jīng)保護劑雖然在Ⅱ、Ⅲ期臨床研究中看到希望，但因藥效/毒性、副作用等原因使其進一步的研究受到限制。中藥復(fù)方具有多組分、多環(huán)節(jié)、多靶點的治療優(yōu)勢，有可能成為今后神經(jīng)保護劑的突破點，將神經(jīng)分子生物學(xué)等現(xiàn)代理念引入中醫(yī)藥的發(fā)展進程中，這樣更有利于弄清疾病發(fā)生、發(fā)展以及中藥治療的分子機制。 本課題觀察急性缺血后海馬、皮層MARCKS磷酸化及其基因表達的動態(tài)變化，探討這些變化與缺血損害的關(guān)系，從蛋白、

4、基因水平探討與證實中藥對腦缺血損害的保護作用及可能的機制，并進一步探討腦缺血損害毒損腦絡(luò)的理論觀點。具體包括以下4部分內(nèi)容及相關(guān)實驗：1急性腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)采用同種系體外微栓子注入法(改良Kaneko法)復(fù)制急性多發(fā)腦梗死大鼠模型，根據(jù)Bederson評分標(biāo)準(zhǔn)，對模型組大鼠進行神經(jīng)系統(tǒng)癥狀觀察，發(fā)現(xiàn)造模后大鼠有不同程度的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。 2急性缺血海馬、皮層MARCKS磷酸化及其基因表達動態(tài)變化應(yīng)用光學(xué)顯微鏡(HE染

5、色)和透射電子顯微鏡觀察急性腦缺血大鼠腦組織形態(tài)學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)造模后大鼠組織形態(tài)學(xué)發(fā)生了明顯的缺血損害，腦缺血易損區(qū)海馬、皮層急性缺血損害的發(fā)生、發(fā)展基本同步；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和westernblot法檢測急性缺血后各時點大鼠海馬、皮層MARCKS、p-MARCKS蛋白表達變化，在海馬和皮層神經(jīng)細(xì)胞胞漿、胞膜中均觀察MARCKS、p-MARCKS的表達，MARCKS、p-MARCKS蛋白在患側(cè)海馬、皮層的表達均為過高表達，缺血24h均

6、變化最顯著(P均＜0.05)；應(yīng)用半定量PCR法檢測缺血各時點患側(cè)海馬、皮層MARCKSmRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)MARCKSmRNA在海馬、皮層缺血后各時點均為過高表達，1h開始升高，7d最高，呈動態(tài)變化，缺血6h、72h、7dMARCKSmRNA表達與正常組和假手術(shù)組相比均(P＜0.01)。 3清腦滴丸對神經(jīng)功能缺損改善及對神經(jīng)細(xì)胞保護作用選取缺血后24h這一急性缺血海馬、皮層MARCKS、p-MARCKS蛋白變化最顯著時點，應(yīng)

7、用清腦滴丸對急性多發(fā)腦梗死大鼠進行預(yù)防給藥，所有大鼠均在造模后24h時點統(tǒng)一處死。造模后觀察到給藥組和模型組均有不同程度的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，中藥組大鼠較模型組的神經(jīng)功能缺損稍輕；應(yīng)用光學(xué)顯微鏡(HE染色)和透射電子顯微鏡觀察各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)中藥組神經(jīng)細(xì)胞受損程度輕于模型組。 4清腦滴丸對急性缺血海馬、皮層MARCKS磷酸化及其基因表達變化的調(diào)節(jié)作用應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和westernblot法檢測清腦滴丸對急性多發(fā)

8、腦梗死大鼠進行預(yù)防給藥后MARCKS、p-MARCKS蛋白表達變化，MARCKS、p-MARCKS蛋白在患側(cè)海馬、皮層模型組、給藥組的表達均為過高表達，模型組表達量均最高(P均＜0.01)，海馬區(qū)中藥組同西藥組無明顯差異(P＞0.05)，皮層區(qū)中藥組同西藥組有明顯差異(P＜0.01)；應(yīng)用半定量PCR法檢測各組大鼠患側(cè)海馬、皮層MARCKSmRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)MARCKSmRNA在海馬、皮層模型組、給藥組的表達均為過高表達，模型組表達

9、最高(P均＜0.01)，海馬區(qū)中藥組同西藥組無明顯差異(P＞0.05)，皮層區(qū)中藥組同西藥組有明顯差異(P＜0.01)。 通過對以上實驗結(jié)果分析整理，得出如下結(jié)論：1急性腦缺血后，模型組大鼠神經(jīng)功能和組織形態(tài)學(xué)均發(fā)生明顯改變，缺血易損區(qū)的MARCKS、p-MARCKS蛋白和基因表達均明顯增高，呈動態(tài)變化，即缺血損害最嚴(yán)重恰是MARCKS磷酸化表達最高峰，表明MARCKS磷酸化與急性腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞損害的發(fā)生和程度密切相關(guān)，信號轉(zhuǎn)

10、導(dǎo)異?？赡苁侨毖獡p害的重要機制； 2清腦滴丸可以改善急性腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損，減輕急性腦缺血時腦組織缺血易缺區(qū)的組織形態(tài)學(xué)的改變，干預(yù)急性腦缺血損害時PKC-MARCKS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)MARCKS蛋白和基因的過高表達，從而減緩神經(jīng)細(xì)胞死亡的過程，減輕急性腦缺血損害； 3解毒通絡(luò)、宣腦開竅法可能通過干預(yù)PKC-MARCKS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)起到神經(jīng)保護作用，MARCKS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)可以為中藥治療急性腦缺血提供新的思路