紅霉素對COPD大鼠組蛋白云乙?；?活性與糖皮質(zhì)激素抵抗的影響及機(jī)制.pdf

1、背景與目的:
　　 慢性阻塞性肺疾病(Chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)是一種以氣流受限為特征的疾病，氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，疾病進(jìn)程多與肺部對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。COPD本質(zhì)上是一種氣道炎癥性疾病，抗炎治療是COPD治療的重要內(nèi)容。其中糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)是目前最重要、作用最強(qiáng)的抗炎劑，近年來糖皮質(zhì)激素在COPD患者中的應(yīng)用日益廣泛，但其

2、療效卻不理想，說明在COPD患者中可能存在某種機(jī)制，導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素抗炎作用減弱，即糖皮質(zhì)激素抵抗。糖皮質(zhì)激素抵抗的相關(guān)機(jī)制包括組蛋白去乙?；?(Histonedeacetylase，HDAC2)活性下降、糖皮質(zhì)激素受體異常、NF-κB激活通路缺乏等，其中HDAC2活性降低是導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素抵抗的主要原因。
　　 HDAC2屬Ⅰ型HDAC，只存在于細(xì)胞核內(nèi)，是參與COPD發(fā)病的主要亞型，與組蛋白乙?；竸?dòng)態(tài)調(diào)節(jié)炎性基因的激活與轉(zhuǎn)錄

3、。組蛋白乙酰化酶催化核心組蛋白分子末端的第5個(gè)賴氨酸殘基(Lys)乙?；?，使組蛋白帶負(fù)電荷，與帶負(fù)電荷的染色質(zhì)結(jié)合疏松，出現(xiàn)DNA解聚效應(yīng)，招募轉(zhuǎn)錄因子，促使炎性基因轉(zhuǎn)錄;而HDAC則使組蛋白發(fā)生去乙?；?，分子與組蛋白的結(jié)合變得更緊密，阻斷基因轉(zhuǎn)錄。研究證實(shí)，COPD大鼠肺組織上皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞的細(xì)胞核中HDAC2的表達(dá)和活性降低，其主要原因是氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激中產(chǎn)生的超氧化陰離子與硝化應(yīng)激中產(chǎn)生的一氧化氮結(jié)合，產(chǎn)生過氧化亞硝酸鹽，或硝

4、化HDAC2上的酪氨酸殘基，或激活PI3K/AKT通路，磷酸化HDAC2的絲氨酸殘基，導(dǎo)致HDAC2蛋白酶體降解失活，HDAC2的活性降低。HDAC2是GC發(fā)揮抗炎作用的中介，HDAC2活性的降低，使GC可以募集到基因表達(dá)位點(diǎn)的HDAC2減少，組蛋白乙?；潭仍鰪?qiáng)，炎癥基因表達(dá)增多，IL-8、TNF-α等炎癥因子釋放增多，GC的抗炎效果削弱。因此增強(qiáng)HDAC2活性是逆轉(zhuǎn)COPD糖皮質(zhì)激素抵抗的重要靶點(diǎn)。
　　 8-異前列腺素F2

5、α(8-iso-PGF2α)是細(xì)胞生物膜上花生四烯酸在氧自由基的作用下發(fā)生脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其產(chǎn)生不依賴酶途徑，且化學(xué)性狀穩(wěn)定，因此被用作評(píng)價(jià)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的理想指標(biāo).國內(nèi)外關(guān)于8-iso-PGF2α研究僅局限與其與氧化應(yīng)激水平、炎癥水平的相關(guān)性，而與HDAC2的相關(guān)性鮮有報(bào)道。
　　 紅霉素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的代表性藥物.它除了具有抗菌活性外，還具有明顯的抗炎、抗氧化活性，可通過抑制NF-B、AP-1的活性抑制IL-8的釋放

6、和中性粒細(xì)胞的活化，還可以減少經(jīng)香煙煙霧提取物體外誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧。另外，與紅霉素同屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的羅紅霉素、阿奇霉素可抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，而PI3K/AKT信號(hào)通路是氧化應(yīng)激降低HDAC2活性的重要通路。紅霉素是否能夠通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活抑制氧化應(yīng)激，增強(qiáng)HDAC2活性，逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素抵抗，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。布地奈德是二代腎上腺皮質(zhì)激素，可通過霧化吸入途徑直接作用于氣道，有一定的抗炎作用

7、，可減輕氣道粘膜炎癥。紅霉素與布地奈德聯(lián)用能否提高布地奈德的局部及全身敏感性，國內(nèi)外未見報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用氣道內(nèi)2次滴入脂多糖加被動(dòng)吸煙法建立COPD大鼠模型，在模型建立成功的基礎(chǔ)上給予紅霉素及布地奈德干預(yù)，觀察紅霉素對COPD大鼠HDAC2活性及糖皮質(zhì)激素抵抗的影響，并探討PI3K/AKT信號(hào)通路在其中的作用。
　　 材料與方法:
　　 健康雄性SD大鼠50只，體重200±20g。隨機(jī)分為:正常對照組（1

8、0只）、COPD組（40只）。COPD組:第1、14天氣道內(nèi)滴入脂多糖，2-13d、15-30d在熏煙箱中被動(dòng)吸煙。健康對照組:第1、14天氣道內(nèi)滴入生理鹽水，2-13d、15-30d在熏煙箱中呼吸空氣。
　　 模型建立后，將COPD組隨機(jī)分為COPD模型組、紅霉素組、布地奈德組、紅霉素+布地奈德組，每組10只。COPD模型組:第31天開始給予生理鹽水灌胃，1次/d，2ml/只，共2周。紅霉素組:第31天開始給予紅霉素灌胃，1次

9、/d，100mg/kg，共2周。布地奈德組:第31天開始霧化吸入布地奈德，1次/d，2ml/只，共2周。紅霉素+布地奈德組:第31天開始給予紅霉素灌胃，劑量及時(shí)間同上，霧化吸入布地奈德，劑量及時(shí)間同上。第45天進(jìn)行肺功能檢測，并留取血液及肺泡灌洗液標(biāo)本，ELISA檢測血清及肺泡灌洗液上清中IL-8、TNF-α、8-iso-PGF2α的水平;肺組織進(jìn)行HE染色以觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化，Western-blot及免疫組化檢測HDAC2、PI3K

10、、p-AKT的表達(dá)。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)描述數(shù)據(jù)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用采用單因素方差分析。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.光鏡觀察各組大鼠肺組織形態(tài)
　　 與正常對照組相比，COPD模型組大鼠氣管及支氣管粘膜上皮細(xì)胞脫落，炎性細(xì)胞浸潤，支氣管平滑肌增厚，膠原沉積，肺泡壁變薄，甚至破裂融合成肺大泡。符合人類COPD氣管及肺組織病理學(xué)變化。各藥

11、物干預(yù)組大鼠肺組織破壞程度較COPD組輕，其中紅霉素+布地奈德組大鼠肺組織破壞最輕。
　　 2.各組大鼠肺功能變化
　　 COPD模型組大鼠，潮氣量(TV)、呼氣峰流速(PEF)、50％潮氣量呼氣峰流速(EF50)分別為1.25±0.73ml、18.49±3.24ml/s、1.38±0.21ml/s，顯著低于正常對照組[1.87±0.76ml、24.96±11.38ml/s、1.73±1.02ml/s]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

12、義(P＜0.001)。紅霉素組[1.68±0.54ml、23.30±10.34ml/s、1.68±0.54ml/s]，布地奈德組[1.52±0.88ml、19.62±10.52ml/s、1.47±0.97ml/s]，紅霉素+布地奈德組[1.72±0.97ml、24.87±10.58ml/s、1.68±0.40ml/s]，均高于COPD模型組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 3.肺泡灌洗液及血清中8-iso-PGF

13、2α水平
　　 正常對照組肺泡灌洗液及血清中8-isoPGF2α的值為19.10±0.91ng/ml、31.65±0.45ng/ml，COPD模型組[37.14±0.21ng/ml、40.74±6.86ng/ml]較正常對照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）;紅霉素組[19.62±0.76ng/ml、28.96±0.55ng/ml]，布地奈德組肺泡灌洗液的值（38.14±3.37ng/ml），紅霉素+布地奈德組[2

14、9.73±0.69ng/ml、19.38±0.74ng/ml]均較COPD模型組明顯降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);但布地奈德組血清中的值（23.50±1.01ng/ml）雖較COPD模型組降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.435);布地奈德組較紅霉素組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);紅霉素+布地奈德組與紅霉素組比較，表達(dá)水平降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.621，0.797）;與布地奈德組比較，表達(dá)水平顯

15、著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 4.肺泡灌洗液及血清中IL-8、TNF-α水平:
　　 正常對照組肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α的值為63.79±3.42ng/L、110.39±9.38ng/L，COPD模型組[127.70±9.32ng/L、280.81±4.48ng/L]，較正常對照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);紅霉素組[64.97±3.05ng/L、117.59±10.71

16、ng/L]，布地奈德組[80.31±3.71ng/L、170.78±12.51ng/L]，紅霉素+布地奈德組[65.47±2.29ng/L、116.86±6.64ng/L]，均較COPD模型組明顯降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);布地奈德組較紅霉素組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);紅霉素+布地奈德組與紅霉素組比較，表達(dá)水平降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.787，0.902）;與布地奈德組比較，表達(dá)水平顯著降低

17、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 正常對照組血清中IL-8、TNF-α的值為99.16±2.23ng/L、240.70±6.68ng/L，COPD模型組[153.82±2.21ng/L、436.76±3.33ng/L]，高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。紅霉素組[110.60±4.33ng/L、275.00±8.28ng/L]，紅霉素+布地奈德組[102.11±2.35ng/L、252.15±7.9

18、5ng/L]，均低于COPD模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);布地奈德組[134.97±2.67ng/L、398.68±7.71ng/L]，低于COPD模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.693，0.505);布地奈德組較紅霉素組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);紅霉素+布地奈德組顯著低于紅霉素組、布地奈德組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.001)。
　　 5.肺組織中HDAC2、PI3K、p-AKT免疫

19、組化:
　　 HDAC2多表達(dá)在支氣管黏膜上皮細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核。PI3K、p-AKT主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞及炎性細(xì)胞。與正常對照組相比較，COPD模型組HDAC2表達(dá)強(qiáng)度降低，PI3K、p-AKT表達(dá)增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。紅霉素組、紅霉素+布地奈德組與COPD模型組相比較，HDAC2表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，PI3K、p-AKT的表達(dá)降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

20、＜0.001)。布地奈德組與COPD模型組比較，HDAC2表達(dá)增強(qiáng)，PI3K、p-AKT的表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.145、0.203、0.178);布地奈德組與紅霉素組比較，HDAC2表達(dá)強(qiáng)度降低，PI3K、p-AKT表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。紅霉素+布地奈德組與紅霉素組相比較，HDAC2表達(dá)增強(qiáng)，PI3K、p-AKT表達(dá)減弱，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.308、0.524、0.252);與B相比

21、較，PI3K、p-AKT表達(dá)明顯減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6.肺組織中HDAC2、PI3K、p-AKT蛋白水平
　　 與正常對照相比較，COPD模型組HDAC2蛋白表達(dá)強(qiáng)度降低，PI3K、p-AKT表達(dá)增強(qiáng)，差異具有顯著性(P＜0.001)。紅霉素組、紅霉素+布地奈德組與COPD模型組相比較，HDAC2蛋白表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，PI3K、p-AKT的表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。布地

22、奈德組與COPD模型組比較，HDAC2表達(dá)增強(qiáng)，PI3K、p-AKT的表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.423、0.706、0.693);布地奈德組與紅霉素組比較，HDAC2表達(dá)強(qiáng)度降低，PI3K、p-AKT表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。紅霉素+布地奈德組與紅霉素組相比較，HDAC2表達(dá)增強(qiáng)，PI3K、p-AKT表達(dá)明顯減弱，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.525、0.533、0.464);與布地奈德組相比較，HD

23、AC2表達(dá)增強(qiáng)，PI3K、p-AKT表達(dá)明顯減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 7.肺組織中HDAC2活性與血清(B)及肺泡灌洗液(F)中8-iso-PGF2α、IL-8、TNF-α水平及肺組織中PI3K、P-AKT活性的相關(guān)性分析
　　 肺組織中HDAC2蛋白水平與血清、肺泡灌洗液中8-iso-PGF2α水平均呈負(fù)相關(guān)，Spearman相關(guān)系數(shù)rSB=-0.985，rSF=-0.834(P＜0.001)

24、。
　　 肺組織中HDAC2蛋白與血清、肺泡灌洗液中IL-8水平呈負(fù)相關(guān)，rSB=-0.974，rSF=-0.886（P＜0.001）;與TNF-α的水平呈負(fù)相關(guān)，rSB=-0.856，rSF=-0.841(P＜0.001)。
　　 肺組織HDAC2蛋白與PI3K蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，rs=-0.98，P＜0.05與p-AKT蛋白呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs=-0.94(P＜0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1

25、、氣道內(nèi)2次（第1、14天）滴入脂多糖聯(lián)合連讀被動(dòng)吸煙28天能成功復(fù)制COPD大鼠模型。
　　 2、COPD大鼠體內(nèi)存在氧化應(yīng)激、炎癥損傷及糖皮質(zhì)激素抵抗，紅霉素能夠抑制氧化應(yīng)激、抑制炎癥因子的產(chǎn)生，與布地奈德合用可顯著提高其抗炎作用。
　　 3、COPD大鼠肺組織中HDAC2表達(dá)減少，氧化應(yīng)激及PI3K/AKT通路可能參與對HDAC2活性的負(fù)性調(diào)節(jié)
　　 4、紅霉素可能通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路增強(qiáng)COP