動(dòng)脈粥樣硬化早期管壁微血管新生的相關(guān)機(jī)制及通絡(luò)干預(yù)研究.pdf

1、目的:本研究以脈絡(luò)學(xué)說(shuō)營(yíng)衛(wèi)“由絡(luò)以通、交會(huì)生化”理論為指導(dǎo)，通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)聯(lián)合頸動(dòng)脈套管置入術(shù)的方法，建立AS早期頸動(dòng)脈損傷的復(fù)合兔模型，通過(guò)觀察管壁微血管新生和神經(jīng)內(nèi)分泌、氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)，探討頸動(dòng)脈管壁微血管新生在AS早期的作用及通絡(luò)藥物的干預(yù)效果，不僅為營(yíng)衛(wèi)“由絡(luò)以通，交會(huì)生化”理論在血管病變中的應(yīng)用提供研究模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，而且有助于闡明AS“由外而內(nèi)”的發(fā)病途徑，對(duì)開辟AS早期的有效防治新途徑具有重要意義。
　　方法

2、:
　　1.高脂聯(lián)合頸動(dòng)脈套管置入術(shù)建立AS早期管壁微血管新生模型及通絡(luò)藥物干預(yù)作用。
　　2.頸動(dòng)脈管壁微血管新生的神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制及通絡(luò)藥物干預(yù)作用。
　　3.頸動(dòng)脈管壁微血管新生的氧化應(yīng)激機(jī)制及通絡(luò)藥物干預(yù)作用。
　　結(jié)果:
　　1.高脂聯(lián)合頸動(dòng)脈套管置入術(shù)建立AS早期動(dòng)脈管壁微血管新生模型及通絡(luò)藥物干預(yù)作用
　　1.1.各組動(dòng)物血脂水平變化。
　　1.2.腹主動(dòng)脈油紅O染色。
　　1

3、.3.頸動(dòng)脈組織Masson染色。
　　1.4.頸動(dòng)脈組織HE染色。
　　1.5.頸動(dòng)脈管壁CD31和VEGF免疫組化染色。
　　1.6.頸動(dòng)脈管壁微血管血流量(MBF)的變化。
　　2.頸動(dòng)脈管壁微血管新生的神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制及通絡(luò)藥物干預(yù)作用
　　2.1.各組實(shí)驗(yàn)兔血漿NE、Ach水平
　　Elisa檢測(cè)實(shí)驗(yàn)兔血漿NE、Ach含量，結(jié)果分析顯示各組血漿NE、Ach含量組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05

4、）。
　　2.2.免疫熒光檢測(cè)動(dòng)脈管壁TH、AchE的定位。
　　2.3.免疫熒光檢測(cè)動(dòng)脈管壁NGF、NPY的表達(dá)。
　　2.4.頸動(dòng)脈組織α1-AR與α7nAchR的蛋白表達(dá)。
　　3.頸動(dòng)脈管壁微血管新生的氧化應(yīng)激機(jī)制及通絡(luò)藥物干預(yù)作用
　　3.1.血清MDA、SOD、T-AOC、CAT與GSH-px水平變化。
　　3.2.ROS在頸動(dòng)脈管壁的分布與外膜定量比較。
　　3.3.頸動(dòng)脈管壁微血

5、管密度MVD與外膜ROS水平的相關(guān)分析。
　　3.4.頸動(dòng)脈管壁NADPH氧化酶亞基p22phox和gp91phox的定位與定量表達(dá)。
　　3.5.頸動(dòng)脈管壁PI3K/AKT和ERK及VEGF-A/VEGFR-2通路相關(guān)蛋白表達(dá)
　　各組PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。p-PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量:與正常組比較，模型組p-PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增高(P＜0.01）;與模型組比較，通心絡(luò)高、

6、中劑量組、阿托伐他汀組、LY294002組p-PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;與阿托伐他汀組比較，通心絡(luò)高劑量組和LY294002組p-PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。p-PI3K/PI3K水平:與正常組比較，模型組p-PI3K/PI3K水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）;與模型組比較，通心絡(luò)高、中劑量組、阿托伐他汀組和LY294002組p-PI3K/PI3

7、K水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);與阿托伐他汀組比較，通心絡(luò)高劑量組和LY294002組p-PI3K/PI3K水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。
　　各組AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量:與正常組比較，模型組p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）;與模型組比較，通心絡(luò)高、中劑量組、阿托伐他汀組、L

8、Y294002組p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）;與阿托伐他汀組比較，通心絡(luò)高劑量組和LY294002組p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量降低顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）。p-AKT/AKT水平:與正常組比較，模型組p-AKT/AKT水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）;與模型組比較，通心絡(luò)高、中劑量組、阿托伐他汀組、LY294002組p-AKT/AK水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

9、1);與阿托伐他汀組比較，通心絡(luò)高劑量組和LY294002組p-AKT/AKT水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。
　　各組MEK蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）。p-MEK蛋白相對(duì)表達(dá)量:與正常組比較，模型組p-MEK蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增高（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組比較，通心絡(luò)高、中劑量組、PD98059組p-MEK蛋白相對(duì)表達(dá)量降低顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

10、1)，阿托伐他汀組p-MEK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P＜0.05);與阿托伐他汀組比較，通心絡(luò)高劑量組和PD98059組p-MEK蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。p-MEK/MEK:與正常組比較，模型組p-MEK/MEK水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）;與模型組比較，通心絡(luò)高、中、劑量組、PD98059組p-MEK/MEK水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);與阿托伐他汀組比較，通心絡(luò)高劑量

11、組和PD98059組p-MEK/MEK水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。
　　各組ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量:與正常組比較，模型組p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增高(P＜0.01）;與模型組比較，通心絡(luò)低、中劑量組和他汀組p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量有一定程度的降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。通心絡(luò)高劑量組、PD98059組p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著減低(P＜0

12、.01）;與阿托伐他汀組比較，通心絡(luò)高劑量組和PD98059組p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P＜0.05）。p-ERK/ERK水平:與正常組比較，模型組p-ERK/ERK水平顯著增高(P＜0.01);與模型組比較，通心絡(luò)中、高劑量組、PD98059組p-ERK/ERK明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);與阿托伐他汀組比較，通心絡(luò)高劑量組和PD98059組p-ERK/ERK水平降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

13、05，P＜0.01)。
　　VEGF-A和VEGFR-2蛋白相對(duì)表達(dá)量:與正常組比較，模型組VEGF-A和VEGFR-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）;與模型組比較，通心絡(luò)高、中劑量組、阿托伐他汀組、LY294002組和PD98059組VEGFR-A顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，通心絡(luò)中劑量組、LY294002組和PD98059組VEGFR-2降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，通心

14、絡(luò)高劑量組和阿托伐他汀組VEGFR-2降低顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與阿托伐他汀組比較，通心絡(luò)高劑量組、LY294002組降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。
　　3.6.免疫組化染色檢測(cè)頸動(dòng)脈管壁p-AKT、p-ERK的定位表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.本研究以脈絡(luò)學(xué)說(shuō)為指導(dǎo)，基于孫絡(luò)與微血管在解剖形態(tài)學(xué)上的同一性，指出了動(dòng)脈管壁“孫絡(luò)—微血管”是營(yíng)氣（血管內(nèi)皮）與衛(wèi)氣（血管外膜及神

15、經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡(luò)）“由絡(luò)以通，交會(huì)生化”重要場(chǎng)所。營(yíng)衛(wèi)“由絡(luò)以通，交會(huì)生化”功能障礙導(dǎo)致的管壁微血管新生是AS發(fā)病的重要病理因素，通過(guò)抑制“孫絡(luò)—微血管”新生能夠延緩或減輕AS早期的血管病變。通過(guò)高脂喂養(yǎng)聯(lián)合頸動(dòng)脈套管置入術(shù)建立頸動(dòng)脈損傷的復(fù)合動(dòng)物模型，可見管壁微血管病理性新生，新生內(nèi)膜形成，加用抑制劑抑制管壁微血管新生，內(nèi)膜增生減輕，從而證實(shí)管壁微血管新生促進(jìn)了AS早期血管病變的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)為上述理論學(xué)說(shuō)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為AS

16、早期防治尋找到有效的治療策略和干預(yù)藥物。
　　2.頸動(dòng)脈管壁的神經(jīng)內(nèi)分泌失衡參與AS早期管壁微血管新生。在AS早期，動(dòng)脈管壁發(fā)生神經(jīng)重構(gòu)，即在于中膜—外膜交界區(qū)域的去甲腎上腺素能神經(jīng)—定程度上消失，但外膜區(qū)域去甲腎上腺素能神經(jīng)再生，以血管外膜局部去甲腎上腺素能神經(jīng)較膽堿能神經(jīng)占相對(duì)優(yōu)勢(shì)。在微血管新生過(guò)程中，頸動(dòng)脈管壁的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)失衡，表現(xiàn)為外膜NGF、NPY及頸動(dòng)脈管壁α1-AR、α7nAchR蛋白表達(dá)明顯增加。
　　3

17、.外膜氧化應(yīng)激是促進(jìn)AS早期管壁微血管新生的重要機(jī)制。隨著管壁p22phox和gp91phox基因表達(dá)明顯升高，外膜ROS生成明顯增多，VEGF-A、VEGFR-2蛋白表達(dá)上調(diào)，管壁微血管新生顯著增加。外膜局部使用阻斷劑后，明顯抑制了PI3K/Akt及ERK通路的激活，同時(shí)下調(diào)VEGF-A、VEGF-R2蛋白表達(dá)，有效減少了微血管新生，說(shuō)明PI3K/Akt與ERK是氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)管壁微血管新生的重要信號(hào)通路。
　　4.通心絡(luò)有效抑制

18、AS早期管壁微血管新生，減輕了血管內(nèi)膜增生，其中通心絡(luò)中劑量與阿托伐他汀療效相當(dāng)，而通心絡(luò)高劑量效果明顯優(yōu)于阿托伐他汀，其機(jī)制與調(diào)節(jié)管壁神經(jīng)內(nèi)分泌的失衡，降低外膜氧化應(yīng)激水半有關(guān)。通心絡(luò)抑制管壁的神經(jīng)重構(gòu)，下調(diào)外膜局部NGF、NPY和管壁α1-AR、α7nAchR蛋白表達(dá);減少管壁p22phox、gp91phox基因表達(dá)和外膜ROS生成，抑制下游PI3K/Akt、ERK通路激活，下調(diào)VEGF-A、VEGFR-2蛋白表達(dá)，從而抑制管壁微血