淡豆豉對早期動脈粥樣硬化損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：本實驗采用高脂飲食復制大鼠早期動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)損傷模型，通過觀察淡豆豉提取物對早期AS損傷大鼠主動脈病理形態(tài)，生化指標、細胞凋亡及其相關基因表達的影響，以進一步研究淡豆豉對大鼠早期動脈粥樣硬化損傷的保護作用及其作用機制。 方法：選用健康成年Sprague.Dawley(SD)大鼠(清潔級)60只，雄性，隨機分為6組，每組10只，每籠5只，分別為正常對照組、病理模型組、陽性藥吉非羅齊組(0

2、.16g/kg)、淡豆豉提取物低劑量組(10g生藥/kg)、淡豆豉提取物中劑量組(20g生藥/kg)、淡豆豉提取物高劑量組(40g生藥/kg)。除正常對照組大鼠給予基礎飼料喂養(yǎng)外，其余各組大鼠每日給予定量高脂飼料(基礎飼料87.48％+豬油10％+膽固醇2％+膽鹽0.5％+甲基硫氧嘧啶0.02％)，動物自由飲水，同時高劑量組每日灌胃給予4g生藥/ml淡豆豉提取物，中劑量組每日灌胃給予2g生藥/ml淡豆豉提取物，低劑量組每日灌胃給予1g生

3、藥/ml淡豆豉提取物，陽性對照組每日灌胃給予0.016g/ml混懸液，病理模型組和正常對照組給予等容量的蒸餾水，灌胃容量均為1ml/100g。10周后，將大鼠用乙醚麻醉，眶后靜脈取血，分離血清。全自動生化分析儀檢測血脂及脂蛋白水平；硝酸還原酶法檢測血清一氧化氮(nitricoxide，NO)含量；放射免疫分析法檢測血清內皮素(endothelincontents，ET)、白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細胞介素

4、-8(interleukin-8，IL-8)水平；流式細胞技術檢測腹主動脈內皮細胞、平滑肌細胞凋亡率、增殖指數及凋亡相關基因Caspase-3、Bcl-2的表達；大鼠用4％多聚甲醛灌注固定后，自主動脈弓處剪取等長的動脈條，沿腹側剖開，內膜面向上，平鋪冰盤上取材：截取lcm主動脈標本，置10％甲醛固定，石蠟切片，HE染色，光鏡顯微鏡下觀察動脈病理組織學改變；取2×3mm<'2>主動脈標本，用2.5％戊二醛2ml固定，掃描電鏡觀察內膜面形態(tài)

5、特點；取2×3mm<'2>主動脈標本用4％戊二醛2ml固定，用1％鋨酸后固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，做超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡觀察內皮細胞及平滑肌細胞形態(tài)學變化。 結果： 1 對早期AS損傷大鼠血脂及脂蛋白的影響病理模型組大鼠血清膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low densitylipoprotein，LDL)、高密

6、度脂蛋白(high density lipoprotein，Ⅷ)L)均較正常對照組升高(P<0.01及P<0.05)，極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)無明顯區(qū)別；淡豆豉提取物各劑量組大鼠血清TC、TG、LDL均較病理模型組大鼠降低(P<0.01及P<0.05)，VLDL、HDL各組無明顯區(qū)別。 2 對早期AS損傷大鼠血清NO和ET的影響病理模型組大鼠血清NO濃度較正常對照組大

7、鼠明顯降低(P<0.01)，ET濃度明顯升高(P<0.01)；與病理模型組比較，淡豆豉提取物各劑量組大鼠血清NO濃度均明顯升高(P<0.01)，淡豆豉提取物高劑量組大鼠ET濃度明顯降低(P<0.01)。 3 對早期AS損傷大鼠血清IL-1和IL-8的影響病理模型組血清IL-1、IL-8水平較正常對照組升高(P<0.01)；淡豆豉提取物高劑量組大鼠血清IL-1、IL-8水平均較病理模型組顯著降低(P<0.05)。 4

8、對早期AS損傷大鼠主動脈內皮細胞(vascular endothelialcell，VEC)凋亡率、增殖指數及相關基因Caspase-3表達的影響病理模型組VEC凋亡率較正常對照組明顯升高，增殖指數明顯降低，Caspase.3表達明顯升高(P<0.01)；與病理模型組相比較，淡豆豉提取物各劑量組VEC凋亡率均明顯降低且增殖指數明顯升高(P<0.01)，淡豆豉提取物低、中劑量組Caspase.3表達下調(P<0.05)。 病理模

9、型組處于G<,0>/G<,1>期的VEC百分比較正常對照組明顯增加，S期和G2M期的細胞減少(P<0.01)；淡豆豉提取物高劑量組處于G<,0>/G<,1>期的VEC百分比較正常對照組明顯減少，S期細胞明顯增加(P<0.01)。 5 對早期AS損傷大鼠主動脈血管平滑肌細胞(vascularsmooth muscle celL VSMC)凋亡率、增殖指數及相關基因Caspase-3、Bcl-2表達的變化病理模型組VSMC凋亡率明顯

10、高于正常對照組(P<0.01)，病理模型組處于G<,0>/G<,1>期的VSMC百分比較正常對照組明顯減少，S期和G2M期的細胞增多，增殖指數明顯高于正常對照組(P<0.01)，病理模型組VSMC的Caspase-3較正常對照組表達升高(P<0.01)，Bcl-2表達下降(P<0.01)。 淡豆豉提取物各劑量組VSMC凋亡率明顯高于病理模型組(P<0.01)，淡豆豉提取物高、中劑量組處于G<,0>/G<,1>期的VSMC百分比

11、較病理模型組明顯增加，S期細胞明顯減少，增殖指數明顯低于病理模型組(P<0.01)，淡豆豉高、中劑量組主動脈平滑肌細胞的Bcl-2基因表達明顯減少(P<0.01)，Caspase-3表達升高(P<0.01)。 6 對早期AS損傷大鼠主動脈形態(tài)學的影響 6.1 光鏡觀察結果正常對照組內膜完整而光滑，中膜平滑肌走行清晰，無增生；病理模型組內皮細胞大部缺失，中膜平滑肌細胞增生明顯，排列紊亂，血管壁增厚；淡豆豉高劑量組內膜光滑

12、連續(xù)，中膜平滑肌厚度均勻，走行無明顯異常。淡豆豉提取物中、低劑量好于病理模型組。 6.2 掃描電鏡觀察正常對照組大鼠內皮細胞界限清楚，排列整齊，連接緊密，膜表面結構清晰；病理模型組大鼠內皮形態(tài)明顯異常，體積縮小，胞膜表面呈大小不等的火山口狀缺損；淡豆豉提取物各劑量組大鼠內皮細胞基本完整，排列較整齊，少量內皮細胞缺損，損傷明顯輕于病理模型組。 6.3 透射電鏡觀察正常對照組內皮細胞完整，細胞間連接緊密，平滑肌細胞外形正

13、常，細胞核完整肌絲豐富；病理模型組內皮細胞破損，內皮間連接處胞質分離，其胞漿內可見脂質空泡形成，平滑肌細胞高度變形，肌絲減少，間質纖維增生；淡豆豉提取物各劑量組可見內皮細胞較完整，細胞連接好。內膜下間隙規(guī)則、清晰，較病理模型組增寬。平滑肌細胞突起減少，胞漿內空泡少見或無，核形狀較規(guī)則。 結論：淡豆豉對早期AS損傷有明顯保護作用，其機制可能與淡豆豉提取物降低早期AS損傷大鼠血清TC、TG、LDL、VLDL水平，調節(jié)脂代謝紊亂，同時