疾病關鍵代謝物溶血磷脂酰膽堿及未衍生化神經遞質的dSPE--LC--MS-MS技術檢測方法研究.pdf

1、目的:
　　為了可以精確檢測健康大鼠腦組織中的溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)和神經遞質，將LC-MS/MS技術與分散固相萃取方法(dispersed solid phase extraction，dSPE)結合，并開展樣品預處理優(yōu)化工作，建立一個快速、重復性好，回收率高，成本低的檢測方法。其中被檢測的溶血磷脂酰膽堿為:LPC(16∶0)，LPC(18∶0)，LPC(18∶1)，LPC(20

2、∶4)，LPC(22∶6);神經遞質為:多巴胺(dopamine，DA)，2-羥苯乙酸(dihydroxy-phenyl acetic acid DOPAC)，5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT），5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA），谷氨酰胺（Glutamine，GLN），γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)。
　　方法:

3、>　　(1)通過質譜直接進樣及液質聯用技術(LC-MS/MS)，采用標準品優(yōu)化每個分析物的質譜參數和液相色譜條件。
　　(2)通過LC-MS/MS技術，采用標準品及組織樣品優(yōu)化樣品預處理過程中的各步驟確定最佳的dSPE方案。具體步驟包括:固相萃取物質的選擇，固相萃取物質粒徑及用量的選擇，樣品復溶溶液的選擇，復溶溶液有機相及有機相比例的選擇，復溶溶液pH的選擇，樣品上清液的稀釋溶劑，沉淀物的洗脫溶劑和洗脫溶劑的pH的選擇。
　

4、　(3)通過方法學驗證，考察dSPE-LC-MS/MS方法的線性范圍，檢測限，定量限，基質效應（絕對回收率），回收率以及日內和日間精密度。
　　結果:
　　(1)通過質譜直接進樣及LC-MS/MS技術，運用各物質的標準品獲得LPC和神經遞質的MRM條件，包括各物質的前體/產物離子對及其DP、EP、CEP、CE、CXP等。
　　(2)從固相萃取物質的萃取率及實驗的成本來看，C18分散顆粒作為最終佳的實驗固相萃取材料。通過

5、比較不同粒徑的萃取率，10μm C18分散顆粒萃取LPC(12∶0)的效率最高，萃取率為56％。C18固相材料的具體使用量為:10mg C18顆粒適用于GABA和GLN，它們的萃取率均在98％以上。25mg C18顆粒適用于其他化合物，它們的萃取率為95％-100％。
　　(3)從各物質的信號響應強度及在不同酸堿環(huán)境下的穩(wěn)定程度來看，5％的MeOH-水(0.1％FA)作為最適合的復溶溶劑，IPA作為固相萃取組織樣品的稀釋溶劑，IP

6、A(0.1％FA)作為沉渣的洗脫溶劑。
　　(4)5-HT，DA，GABA，GLN的標準線性范圍為10-1000ng/mL，5-HIAA，DOPAC，LPC的標準線性范圍為50-1000ng/mL。通過考察方法的回收率，7種化合物在低中高3個濃度范圍內的平均回收率為65.17％-11489％，CV為0.00％-8.68％。即所有化合物的回收率高于65％，偏差小于8.68％。日內精密度的變異系數在0.20％-14.7％之間，日間精密