水稻抗病基因人工進化的初步研究.pdf

1、利用抗性基因培育抗性品種是防治水稻病蟲害最直接、環(huán)保、經(jīng)濟、有效的方法。但目前水稻可利用R基因數(shù)量較少，且多數(shù)為等位變異基因，過度利用這些抗性基因會引起病原菌快速進化，將導(dǎo)致基因抗性功能的喪失。因此，需要不斷挖掘新的抗性基因，豐富抗性基因資源。同時要對抗病基因的結(jié)構(gòu)和功能特點及病原物進化的特點進行研究，進而達到可以通過人為地設(shè)計和創(chuàng)造抗性基因來提高品種抗性的目的。
　　對CC-NBS-LRR抗性基因作用模式研究表明，LRR通常參與

2、病原物的識別和NB-LRR蛋白功能的開啟與關(guān)閉，而CC-NB-ARC結(jié)構(gòu)域則可能會出現(xiàn)自激活的現(xiàn)象。同時，R基因異源表達和PRR基因間嵌合構(gòu)建的研究表明，結(jié)構(gòu)域在物種間和物種內(nèi)都有一定的保守性和融合性。基于這種保守性和融合性，我們將白葉枯抗性基因Xa21D和稻瘟病基因Pi36、Pb1、Pita的保守功能域進行劃分和相互融合，構(gòu)建新的抗性基因，同時將Xa21D GC-Rich Region進行變異，構(gòu)成不完整的Xa21D進行轉(zhuǎn)基因功能驗證

3、。希望通過對稻瘟病和白葉枯病的抗性鑒定，可以有效地探尋Xa21D控制功能關(guān)鍵結(jié)構(gòu)或元件，以及四個抗性基因LRR與CC-NB-ARC或SignalSequence-GC-rich region作用特點，為進一步研究作用機制提供一定研究基礎(chǔ)。同時也可以探索這種基因嵌合方式實現(xiàn)廣譜和高效地白葉枯病和稻瘟病融合免疫反應(yīng)的可能。取得以下初步結(jié)果:
　　1、根據(jù)文獻分析和網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果，將Xa21D的結(jié)構(gòu)域劃分為Signal Sequence、

4、GC-rich region和LRR region三部分，Pb1、Pi36和Pita的結(jié)構(gòu)CC-NB-ARC、Link/Spacer和LRR region三部分。將四個基因按照驗證結(jié)構(gòu)域功能和創(chuàng)制廣譜白葉枯病和稻瘟病的目的，設(shè)計了8個結(jié)構(gòu)域來源不同的嵌合抗病基因。
　　2、按照設(shè)計要求，成功從四個抗病基因的擴增需要的片段，利用Overlap-PCR將片段按照設(shè)計要求進行拼接，獲得了8個嵌合體的全長片段，并成功將其構(gòu)建到植物表達載體

5、PHB中。以水稻粳稻品種TP309作為受體材料，進行水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。目前獲得了RiLP2403、RiLP2406和RiLP2407的轉(zhuǎn)基因T0代陽性植株，目前其他嵌合體基因仍在遺傳轉(zhuǎn)化中。
　　3、分別對RiLP2403、RiLP2406和RiLP2407三個嵌合體基因的轉(zhuǎn)基因陽性植株進行了初步的稻瘟病抗性鑒定，結(jié)果表明三個基因均表現(xiàn)出一定的稻瘟病抗性功能，說明三個嵌合體中有結(jié)構(gòu)域起免疫功能。
　　4、RiLP2403表現(xiàn)出

6、對稻瘟病菌株有明顯的抗感差異，說明Pi36 LRR可能參與了稻瘟病效應(yīng)因子的識別，但尚不能確定其通過間接，還是直接的識別方式。而Xa21DSignal Sequence和GC-Rich未知區(qū)域具有可能也是參與免疫反應(yīng)的重要成分，特別是GC-Rich區(qū)域。
　　5、而RiLP2406和RiLP2407鑒定結(jié)果不能明確其作用結(jié)構(gòu)域，但可以推測出一些較為可靠的線索。特別是，RiLP2406是由來自于Pi36的CC-NB-ARC區(qū)域，Xa

7、21D的GC-Rich未知區(qū)域和LRR區(qū)域構(gòu)成，具有抗白葉枯和稻瘟病兩種病害抗性的可能，需要進一步的進行稻瘟病和白葉枯病的鑒定才能明確。
　　本研究利用抗病基因結(jié)構(gòu)域的保守型和融合性特點，將白葉枯病抗性基因Xa21D和稻瘟病抗性基因Pb1，Pi36和Pita各功能域進行劃分和融合。獲得8個結(jié)構(gòu)域來源不同的嵌合抗病基因，通過轉(zhuǎn)基因驗證了部分功能域在抗性反應(yīng)中的功能，鑒定結(jié)果表明，部分嵌合基因表現(xiàn)出稻瘟病抗性功能，并且有實現(xiàn)廣譜白葉枯