缺氧-復氧誘導人臍靜脈內皮細胞釋放的微囊泡對離體大鼠胸主動脈環(huán)舒張功能的影響.pdf

1、血管內皮功能紊亂是多種心血管疾病致病機制的起始及核心環(huán)節(jié)，是急性心肌梗死，動脈粥樣硬化等心血管疾病的致病基礎。研究表明，糖尿病、動脈粥樣硬化、心肌缺血等心血管疾病的患者循環(huán)血液中MVs水平上升，這些MVs中包含內皮細胞在受到刺激或凋亡時所釋放的EMVs。EMVs并非簡單的生物學標志物，它們同時在血管內皮功能紊亂的致病機制中發(fā)揮著重要作用。不同病理狀態(tài)下產生的EMVs具有不同的生物學功能。I/R作為多種心血管疾病的病理生理基礎，可引起血管

2、內皮功能紊亂及凋亡壞死。但有關 H/R誘導產生的H/R-EMVs是否在血管內皮功能紊亂中發(fā)揮作用以及 H/R-EMVs是否可以削弱離體大鼠胸主動脈環(huán)的內皮依賴性舒張反應尚不清晰。因此，本實驗擬通過H/R誘導HUVECs產生EMVs，探討H/R-EMVs對離體大鼠胸主動脈環(huán)舒張功能的影響。
　　目的：
　　研究H/R-EMVs對離體大鼠胸主動脈環(huán)舒張功能的影響及其相關機制。
　　方法：
　　1. H/R誘導HUVE

3、Cs損傷模型的建立
　　用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs24 h達到融合70-80%后，棄去培養(yǎng)上清液，換用缺氧液。將HUVECs放置于缺氧裝置中，使用95%N2-5%CO2混合氣，流速20 L/min，充氣15 min以排出缺氧裝置中的空氣。將HUVECs細胞在缺氧裝置中缺氧培養(yǎng)12 h，繼而復氧培養(yǎng)4 h。通過MTT法檢測細胞存活率，建立H/R誘導HUVECs損傷的模型。
　　2. H/R-EMVs的獲取

4、、流式鑒定及定量檢測
　　采取梯度離心的方法從細胞H/R的培養(yǎng)上清液中收集H/R-EMVs，應用1μm標準微球和PE-CD144抗體標記，流式細胞儀對H/R-EMVs進行鑒定；采用2μm標準微球對H/R-EMVs進行計數；BCA法對H/R-EMVs進行蛋白定量。
　　3.離體大鼠胸主動脈環(huán)的制備
　　選取Wistar雄性大鼠，體重250±10 g左右，頸脫臼處死，開胸，獲取胸主動脈。將胸主動脈放入盛有4℃ K-H液的培

5、養(yǎng)皿中，用眼科剪小心去除包住胸主動脈的筋膜，將動脈剪成3-4 mm的胸主動脈環(huán)。
　　4.不同濃度H/R-EMVs處理離體大鼠胸主動脈環(huán)
　　用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)離體大鼠胸主動脈環(huán)。實驗分為正常對照組(Control)，H/R-EMVs2.5,5,10,20μg/mL組，共5組。H/R-EMVs2.5,5,10,20μg/mL組分別加入2.5,5,10,20μg/mL的H/R-EMVs，Control組加入等

6、體積的D-Hank’s液，孵育4 h。
　　5.不同濃度ACh，SNP介導的離體大鼠胸主動脈環(huán)舒張率的測定
　　將離體大鼠胸主動脈環(huán)連接到離體組織灌流裝置，調整預負荷為2g。使用PE10-6 mol/L預收縮離體大鼠胸主動脈環(huán)使其收縮達最大值。15 min后，分別使用10-9-10-6 mol/L的ACh及SNP測定離體大鼠胸主動脈環(huán)舒張率。
　　6.離體大鼠胸主動脈環(huán)中NO含量的測定
　　采用Griess Re

7、agent法，測量離體大鼠胸主動脈環(huán)中NO的含量。
　　7.離體大鼠胸主動脈環(huán)中p-eNOS/t-eNOS的測定
　　Western blot法檢測離體大鼠胸主動脈環(huán)中p-eNOS/t-eNOS的表達。
　　8.離體大鼠胸主動脈環(huán)中SOD，MDA含量的測定
　　SOD，MDA試劑盒測定離體大鼠胸主動脈環(huán)中SOD，MDA的含量。
　　結果：
　　1. H/R誘導HUVECs損傷模型的建立
　　在缺

8、氧12 h復氧4 h處理后，HUVECs出現(xiàn)皺縮和變形，部分細胞懸浮在培養(yǎng)液中。與 Control比較，MTT檢測細胞存活率顯著降低(73.73%±2.61% vs100%±0%，P<0.05)，其降低程度適中，實驗結果穩(wěn)定，適宜采用該模型誘導HUVECs損傷。
　　2. H/R-EMVs的獲取、流式鑒定及定量檢測
　　低溫超速離心后，可以觀察到超速離心管底部有肉眼可見的較小面積的白色沉淀，即為H/R-EMVs。流式檢測證實

9、誘導得到粒徑<1μm且CD144+的微粒，計數結果為23017±322/μL。H/R-EMVs蛋白濃度為0.35±0.10μg/μL。
　　3. H/R-EMVs對ACh及SNP介導的離體大鼠胸主動脈環(huán)舒張率的影響
　　與Control組(93.59%±7.53%)比，H/R-EMVs5,10,20組由ACh介導的離體大鼠胸主動脈環(huán)舒張率(81.11%±6.12%,67.71%±5.96%,43.50%±9.35%，P<0.

10、05或P<0.01)顯著降低。H/R-EMVs在濃度范圍為5-20μg/mL時劑量依賴性的降低了ACh介導的離體大鼠胸主動脈環(huán)舒張率；與Control組比，H/R-EMVs2.5組由ACh介導的離體大鼠胸主動脈環(huán)舒張率(99.53%±2.47%)無統(tǒng)計學差異。SNP介導的離體大鼠胸主動脈環(huán)舒張率在各組之間無統(tǒng)計學差異。
　　4. H/R-EMVs對離體大鼠胸主動脈環(huán)中NO含量的影響
　　與Control組(84.64±4.3

11、7μmol)相比，H/R-EMVs5,10,20μg/mL組NO含量(72.61±0.81,34.58±1.97,21.45±1.16μmol，P<0.01)顯著降低。H/R-EMVs在濃度范圍為5-20μg/mL時劑量依賴性的降低了離體大鼠胸主動脈環(huán)中NO的含量。與Control組相比，H/R-EMVs2.5組NO含量(88.26±4.68μmol)無統(tǒng)計學差異。
　　5. H/R-EMVs對離體大鼠胸主動脈環(huán)中p-eNOS/t

12、-eNOS表達的影響
　　Western blot結果顯示，與Control組相比，隨H/R-EMVs濃度增加，H/R-EMVs5,10μg/mL和H/R-EMVs20μg/mL組p-eNOS蛋白表達減少，t-eNOS蛋白表達不變，p-eNOS/t-eNOS比值下降。H/R-EMVs在濃度范圍為5-20μg/mL時，劑量依賴性的降低了離體大鼠胸主動脈環(huán)中 p-eNOS的含量。與 Control組相比，H/R-EMVs2.5μg/m

13、L組離體大鼠胸主動脈環(huán)p-eNOS蛋白表達無統(tǒng)計學差異。
　　6. H/R-EMVs對離體大鼠胸主動脈環(huán)中SOD活性及MDA含量的影響
　　與 Control組相比(SOD:52.22±1.25 U/mg prot; MDA:1.91±0.11μmol/mg prot)，H/R-EMVs5,10和H/R-EMVs20μg/mL組離體大鼠胸主動脈環(huán)SOD活性下降(23.44±0.99,17.28±0.63,10.88±0.54

14、 U/mg prot，P<0.01)，MDA含量上升(3.27±0.19,8.08±0.19,10.22±0.17μmol/mg prot，P<0.01)。H/R-EMVs在濃度范圍為5-20μg/mL時，劑量依賴性的降低了離體大鼠胸主動脈環(huán)中SOD的活性并提高了MDA的含量。與Control組比，H/R-EMVs2.5μg/mL組離體大鼠胸主動脈環(huán)SOD活性(51.48±2.12 U/mg prot)及MDA含量(1.97±0.13μ

15、mol/mg prot)無統(tǒng)計學差異。
　　結論：
　　1.本實驗成功建立了缺氧12 h復氧4 h誘導HUVECs損傷的模型。
　　2.采用缺氧12 h復氧4 h的方法誘導HUVECs產生H/R-EMVs，流式檢測證實誘導得到粒徑<1μm且CD144+的H/R-EMVs，其蛋白濃度為0.35±0.1μg/μL。
　　3. H/R-EMVs的劑量在5-20μg/mL范圍內時，劑量依賴性的削弱了離體大鼠胸主動脈環(huán)的舒

16、張率。
　　4. H/R-EMVs的劑量在5-20μg/mL范圍內時，劑量依賴性的降低了離體大鼠胸主動脈環(huán)的NO含量，NO含量降低導致離體大鼠胸主動脈環(huán)舒張率的下降。
　　5. H/R-EMVs的劑量在5-20μg/mL范圍內時，劑量依賴性的降低了p-eNOS蛋白的表達，對t-eNOS的表達無影響。提示H/R-EMVs可能通過下調p-eNOS的表達從而減少NO的產生。
　　6. H/R-EMVs誘導了OS反應的發(fā)生，H