內(nèi)皮祖細胞生嚴重創(chuàng)傷性腦損傷患者外周血中表達及預后的意義.pdf

1、背景：EPCs(endothelial progenitor cells)來源于胚胎的中胚層和出生后的骨髓，不僅參與胚胎血管生成，而且近年研究發(fā)現(xiàn)，EPC也參與出生后的血管新生過程，是一群被發(fā)現(xiàn)存在于胎肝、臍帶血和成人外周循環(huán)血中的、能夠分化為內(nèi)皮細胞的多潛能細胞，這群細胞不但具有修復損傷內(nèi)皮細胞的功能而且還能增強組織缺血后的血管發(fā)生(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)，提示在缺血性疾病、防止血管再狹窄

2、、血管創(chuàng)傷愈合等過程中具有重要的治療作用。最近的研究顯示：EPCs可促進顱腦創(chuàng)傷大鼠損傷區(qū)腦組織的血管、神經(jīng)新生以及神經(jīng)功能恢復，這為下一步的臨床應用奠定了基礎。
　　 目的：
　　 1.研究創(chuàng)傷性腦損傷患者外周血來源內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)、增殖及鑒定。
　　 2.探討循環(huán)內(nèi)皮祖細胞對創(chuàng)傷性腦損傷患者血管損傷修復的可能機制。
　　 3.探討顱腦損傷對循環(huán)內(nèi)皮祖細胞的動員及預后判斷的意義。
　　 方

3、法：
　　 1.應用密度梯度離心法分離創(chuàng)傷性腦損傷患者外周血單個核細胞，應用EGM培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3天換液去除未貼壁細胞，以后每3天換液一次，倒置相差熒光顯微鏡下動態(tài)觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)變化特征。通過硫氰酸熒光素標記的乙?；兔芏戎鞍?DiI-ac-LDL)攝取試驗和荊豆凝集素(FITC-UEA-1)結(jié)合實驗，進行內(nèi)皮祖細胞的功能鑒定。體外培養(yǎng)至第7天，采用流式細胞儀檢測CD34，CD133雙熒光

4、標記陽性細胞所占比率。
　　 2.連續(xù)收集2009年1月至2010年4月天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經(jīng)外科治療的重型創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)而無肢體損傷患者外周血及血清標本。創(chuàng)傷性顱腦損傷患者損傷程度由Glasgow Coma Scale(GCS)評分決定。同期收集18-60歲健康志愿者外周血及血清標本。嚴重創(chuàng)傷性腦損傷患者及對照組外周血內(nèi)皮祖細胞數(shù)量分別在腦損傷后的1天、4天、7天、14天及21天用流式細胞儀進行檢測。在相同時間點對上述

5、兩組血清的血管生成素(Ang-1)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)進行ELISA檢測。
　　 3.收集嚴重創(chuàng)傷性腦損傷患者21例及20例正常對照組的外周血及血清標本。分別于創(chuàng)傷性腦損傷后的1天、4天、7天、14天及21天用流式細胞儀檢測外周血內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量及用ELISA檢測血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)變化。并對創(chuàng)傷性腦損傷患者傷后6個月的glasgow outcome scale(GOS)評

6、分進行前瞻性的分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.培養(yǎng)3天換液去除未貼壁細胞后，可見少數(shù)細胞呈集落式生長，細胞形態(tài)多為短梭型或多角形。培養(yǎng)7天，梭型細胞較前增多，形成細胞團。14天可見到細胞形成索狀或網(wǎng)狀血管樣結(jié)構(gòu)。倒置相差熒光顯微鏡下觀察顯示胞質(zhì)和胞膜呈綠色和紅色雙熒光，說明內(nèi)皮祖細胞能特異性吸附DiI-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-1，具有內(nèi)皮細胞功能。流式細胞儀鑒定EPC細胞表型CD34和CD133雙陽性的細胞為1

7、8.57％。
　　 2.與對照組相比，循環(huán)內(nèi)皮祖細胞在嚴重創(chuàng)傷性腦損傷后第4天降低，第7天達到最高。血管內(nèi)皮生長因子水平始終高于對照組水平。血管生成素1在第14天到達最高峰。循環(huán)內(nèi)皮祖細胞與嚴重腦創(chuàng)傷后7天、14天的Ang-1和VEGF血清水平明顯相關。
　　 3.與對照組相比，循環(huán)內(nèi)皮祖細胞的變化與前期研究一致。顱腦創(chuàng)傷后第7天達到高峰，并且與患者傷后6個月的GOS評分明顯相關。MMP-9和VEGF水平傷后始終高于對照

8、組。循環(huán)內(nèi)皮祖細胞與創(chuàng)傷性腦損傷后1天的GCS評分相關，與創(chuàng)傷性腦損傷后7天、14天的MMP-9和VEGF水平相關。
　　 結(jié)論：
　　 1.創(chuàng)傷性腦損傷患者外周血來源的單個核細胞在體外應用EGM培養(yǎng)基培養(yǎng)，可以分化為內(nèi)皮祖細胞，為內(nèi)皮祖細胞研究奠定了基礎。
　　 2.血管生成素-1(Angiopoietin-1)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是調(diào)節(jié)血管生成反應和維持血管完整性的兩個關鍵性蛋白，在患者腦創(chuàng)傷后14

9、天達到峰值，并且在腦創(chuàng)傷后7天、14天分別與內(nèi)皮祖細胞相關，這些結(jié)果提示嚴重創(chuàng)傷性腦損傷后血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素-1及循環(huán)內(nèi)皮祖細胞有可能參與到了血管修復的病理生理過程中。
　　 3.我們的研究結(jié)果顯示創(chuàng)傷性腦損傷后循環(huán)內(nèi)皮祖細胞升高，MMP-9和VEGF可能參與調(diào)節(jié)嚴重創(chuàng)傷性腦損傷后內(nèi)皮祖細胞由骨髓動員至外周血的過程當中。我們的研究結(jié)果還顯示循環(huán)內(nèi)皮祖細胞與患者的神經(jīng)功能恢復相關聯(lián)，這些證據(jù)提示循環(huán)內(nèi)皮祖細胞是判斷血管新