BCL2A在小鼠創(chuàng)傷性腦損傷及體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)變化的研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一。腦損傷后常伴有明顯的炎癥反應(yīng)，一般來(lái)說(shuō)，這種炎癥反應(yīng)是有利的，然而過(guò)度的炎癥反應(yīng)可能會(huì)對(duì)機(jī)體帶來(lái)?yè)p害。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)固有的小膠質(zhì)細(xì)胞和由血液浸潤(rùn)而來(lái)的巨噬細(xì)胞是這種炎癥反應(yīng)的主要參與者。小膠質(zhì)細(xì)胞類型特異的RNA測(cè)序結(jié)果表明，Bcl2a的mRNA特異地在小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄。本研究以此為基礎(chǔ)。B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白是重要的細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)分子，其主要功能是控制內(nèi)源性凋亡途

2、徑中從線粒體釋放細(xì)胞色素c。Bcl2蛋白家族包括促進(jìn)和抑制凋亡蛋白，它們通過(guò)多種方式互相作用。由于其在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要作用，有許多抗凋亡Bcl-2蛋白被確定為重要的細(xì)胞癌基因和抗癌治療的有吸引力的目標(biāo)。本課題對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)蛋白2a（Bcl2a），Bcl2蛋白家族中一個(gè)抑制細(xì)胞凋亡的蛋白分子進(jìn)行了調(diào)查研究，旨在回答如下問(wèn)題：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，Bcl2a表達(dá)于什么細(xì)胞類型？是否在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)？機(jī)械性腦損傷之后以及在不同刺激條件下的體

3、外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞中，Bcl2a的表達(dá)是如何調(diào)節(jié)的？
　　目的：建立小鼠機(jī)械性腦損傷模型，研究Bcl2a在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后表達(dá)變化情況，探討它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷與修復(fù)過(guò)程中可能的功能與意義。利用LPS或機(jī)械劃傷刺激體外培養(yǎng)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞，檢測(cè)Bcl2a的表達(dá)情況，探討B(tài)cl2a在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的變化和調(diào)節(jié),以期為探索調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的活化及反應(yīng)特征提供新的思路。
　　方法：采用手術(shù)刀片劃傷小鼠端腦大腦皮層的方法建

4、立小鼠機(jī)械性腦損傷模型，首先用RT-PCR、Western blot技術(shù)檢測(cè)Bcl2a在小鼠腦損傷之后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況；接著利用免疫組化（IHC）及免疫熒光多重標(biāo)記技術(shù)（IF）觀察Bcl2a在大腦中的表達(dá)變化及細(xì)胞定位情況。運(yùn)用IHC/IF雙標(biāo)記Bcl2a與小膠質(zhì)細(xì)胞marker CD11b，神經(jīng)元marker NeuN,以檢測(cè)Bcl2a在腦損傷之后細(xì)胞定位是否發(fā)生變化；體外培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞，用不同濃度的LPS及機(jī)械劃傷刺激原代小

5、膠質(zhì)細(xì)胞，然后用免疫熒光雙標(biāo)記去檢測(cè)Bcl2a的表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示，在正常腦內(nèi)，Bcl2a蛋白主要在神經(jīng)元上弱表達(dá)，在靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較少。在機(jī)械性腦損傷后，RT-PCR結(jié)果顯示，在損傷腦區(qū)Bcl2a的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，損傷后3d其mRNA表達(dá)明顯高于1d而達(dá)頂峰。Western blot結(jié)果顯示，在損傷后Bcl2a蛋白翻譯水平顯著增加，于損傷后3-7d達(dá)頂峰，之后Bcl2a的蛋白表達(dá)恢復(fù)正常

6、。免疫熒光多重標(biāo)記及激光共聚焦掃描結(jié)果揭示，在損傷腦區(qū)Bcl2a蛋白表達(dá)上調(diào)的主要細(xì)胞是激活的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。不同濃度LPS刺激原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞后，Bcl2a的蛋白表達(dá)量增加，而且呈濃度依賴性上調(diào)。同一濃度的LPS刺激原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞，Bcl2a的蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性上調(diào)。單純的機(jī)械性劃痕也引起B(yǎng)cl2a蛋白在劃傷的小膠質(zhì)細(xì)胞的上調(diào)。
　　結(jié)論：⑴Bcl2a在正常神經(jīng)系統(tǒng)主要在神經(jīng)元上弱表達(dá)，在靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較少