HaCaT細(xì)胞和A431細(xì)胞在UVB應(yīng)激作用后的生物學(xué)特性的差異及其機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　 紫外線(ultraviolet,UV)是電磁波譜中波長為100～400nm的輻射的總稱,人類社會(huì)活動(dòng)中接觸到的紫外線主要來源于太陽輻射和一些人工光源,其中來自太陽的紫外線約占太陽光譜的5％。根據(jù)紫外線的波長和生物學(xué)效應(yīng)的不同,可以分為3個(gè)波段:長波紫外線 UVA(long-wave ultraviolet,320～400nm),能穿透人類皮膚真皮層；中波紫外線 UVB(290～320nm),可穿透皮膚幾毫米；短

2、波紫外線UVC(short-waveultraviolet,200～290nm),穿透力較弱,是紫外線輻射殺菌的主要部分。由于地球上方臭氧層的阻擋和過濾作用,使太陽紫外線中全部的UVC和大部分UVB被屏蔽,從而使到達(dá)地球表面的紫外線絕大部分的是UVA(約占90-99％)和少量的UVB(約占1-10％),盡管UVB的含量較低,但是UVB的致癌能力卻是 UVA的1,000到10,000倍。
　　 UVB是已經(jīng)被確認(rèn)的自然環(huán)境中的環(huán)境

3、致癌因子,臭氧空洞的形成和擴(kuò)大使得到達(dá)地球表面的紫外線輻射量(尤其是IYVB)較以往增多,隨之而來的皮膚疾病和皮膚癌的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢,全球范圍內(nèi),每年新增大約2,500,000例非黑素瘤皮膚癌患者和132,000例惡性黑素瘤患者,在日光下的慢性照射是基底細(xì)胞癌(BCCs)和鱗狀細(xì)胞癌(SCCs)發(fā)生的主要原因,BCCs和SCCs同樣都發(fā)病于皮膚基底層,SCCs具有侵襲性,超過10％的SCCs能夠發(fā)生遷移,而BCCs不會(huì)發(fā)生遷移

4、,但是其在局部具有較強(qiáng)的侵襲性和毀壞性。目前,對(duì)UVB致皮膚損傷機(jī)制的研究已經(jīng)是國內(nèi)及國際學(xué)術(shù)界和醫(yī)療界的熱點(diǎn)問題。
　　 皮膚是人體最大的器官,覆蓋于機(jī)體表面,在對(duì)抗外界環(huán)境的物理、化學(xué)和生物等刺激時(shí)起到機(jī)械屏障和保護(hù)作用,皮膚的角質(zhì)細(xì)胞還參與各種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程,如免疫、炎癥、增生以及腫瘤轉(zhuǎn)化等,同時(shí)又與體內(nèi)各臟器有著緊密的聯(lián)系,從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。正因?yàn)槠つw裸露于外環(huán)境中,它比其它器官接受更多來自外界環(huán)境紫外線的輻射,

5、角質(zhì)層處在皮膚的最外層,角質(zhì)形成細(xì)胞占表皮細(xì)胞的90％以上,是 UVB作用的主要靶細(xì)胞,照射到皮膚的紫外線95％的被角質(zhì)細(xì)胞所吸收。而環(huán)境中UVB的增加,無疑會(huì)加重對(duì)皮膚角質(zhì)細(xì)胞的損傷,引起皮膚的紅斑、炎癥,甚至皮膚癌等。UVB對(duì)DNA有直接的損傷作用,并能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯(Cellcycle arrest)。UVB還是一種重要的氧化應(yīng)激(Oxidative stress)因素,UVB輻射產(chǎn)生的活化氧簇(Reactive oxy

6、gen species,ROS)可破壞皮膚的酶及非酶性抗氧化防御系統(tǒng),使機(jī)體易受損,造成皮膚老化、皮膚腫瘤等病理狀態(tài)。目前認(rèn)為ROS在UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和凋亡中發(fā)揮重要的作用。
　　 研究目的：
　　 UVB被認(rèn)為是誘發(fā)皮膚癌的主要因素,皮膚癌起始于皮膚角質(zhì)化細(xì)胞,因此研究UVB致皮膚角質(zhì)化細(xì)胞損傷的機(jī)理具有十分重要的意義。本研究通過觀察 UVB輻射對(duì) HaCaT細(xì)胞損傷的生物學(xué)效應(yīng),深入探討 UVB致皮膚損傷的機(jī)

7、理,并與 A431細(xì)胞比較,分析不同種類細(xì)胞對(duì)UVB輻射不同的生物學(xué)反應(yīng)；另外,我們初步探討紅景天苷在 UVB誘導(dǎo)細(xì)胞細(xì)胞壞死和凋亡中的作用,為皮膚癌的光化學(xué)預(yù)防和治療尋找新的天然藥物。
　　 研究方法：
　　 1.用不同劑量(0、10、30、50、70、100 J/m2)的UVB分別照射 HaCaT細(xì)胞和A431細(xì)胞,并繼續(xù)培養(yǎng)24h后,MTT法檢測細(xì)胞存活率；用50 J/m2劑量 UVB照射HaCaT細(xì)胞和A431細(xì)

8、胞后繼續(xù)培養(yǎng),在照后不同培養(yǎng)時(shí)間(2、4、8、12、24h)使用MTT法檢測細(xì)胞存活率,觀察比較兩種細(xì)胞存活率的變化。
　　 2.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測50 J/m2的UVB照射后培養(yǎng)至12h的 HaCaT細(xì)胞和 A431細(xì)胞周期的變化,分析 UVB對(duì)細(xì)胞周期的影響及與凋亡的關(guān)系。
　　 3.用RT-PCR和 Western blot法,分別從RNA水平和蛋白水平檢測 UVB照射后HaCaT細(xì)胞和 A431細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)(

9、2、4、8、12、24h)NF-kB、Bcl-2和CDK6的表達(dá)情況,探討 NF-kB信號(hào)通路及相關(guān)蛋白在UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中的作用。
　　 4.應(yīng)用 MTT法檢測不同濃度(100、300、500μg/ml)紅景天苷預(yù)處理的 HaCaT細(xì)胞和A431細(xì)胞在UVB照射后24h的存活率,并與陽性對(duì)照組比較,探討紅景天苷的對(duì)細(xì)胞是否存在保護(hù)或者殺傷的藥效作用。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞和A4

10、31細(xì)胞存活率的影響存在時(shí)間依賴性和劑量依賴性,隨著 UVB照射劑量的增加,細(xì)胞存活率逐漸降低；50 J/m2劑量的UVB照射后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,細(xì)胞的存活率逐漸降低,但A431細(xì)胞在24h時(shí)間點(diǎn)的存活率略有回升。在兩種細(xì)胞之間,不同劑量照射后培養(yǎng)24h的細(xì)胞存活率沒有顯著差異；50 J/m2劑量照射后培養(yǎng)不同時(shí)間的MTT結(jié)果表明:兩種細(xì)胞在 UVB照射后4h和8h的存活率沒有顯著差異(P>0.05),在此之前的2h時(shí)間點(diǎn)A431存活

11、率略高于HaCaT細(xì)胞(P<0.05),而12h的結(jié)果與2h結(jié)果相反,HaCaT細(xì)胞存活率略高于A431(P<0.05),兩種細(xì)胞的存活率在24h基本相同。
　　 2.HaCaT細(xì)胞經(jīng)50 J/m2照射后12h發(fā)生G0/G1期阻滯,并且出現(xiàn)明顯的凋亡峰。而在A431細(xì)胞中,細(xì)胞周期分布基本沒有改變。
　　 3.在HaCaT細(xì)胞中,UVB照射能夠誘導(dǎo)NF-kB信號(hào)通路的激活,上調(diào)NF-kB/p65的表達(dá),與對(duì)照組相比在8h

12、有顯著性差異,并持續(xù)高表達(dá)至24h,同時(shí)UVB照射也能夠引起 Bcl-2和CDK6基因的高表達(dá)；在A431細(xì)胞中有與上述相似的結(jié)果。
　　 4.在紅景天苷藥效學(xué)的研究中(紅景天苷對(duì) A431細(xì)胞和 HaCaT細(xì)胞在UVB照射后的影響):對(duì)于A431細(xì)胞,單純UVB照射組細(xì)胞的存活率低于陽性對(duì)照組(P<0.05),UVB促細(xì)胞凋亡和壞死作用明顯；而陽性對(duì)照組和單獨(dú)用藥組之間差異無顯著性意義(P>0.05),說明紅景天苷藥物對(duì)細(xì)胞沒

13、有毒性作用；在50 J/m2 UVB照射并給予不同劑量的紅景天苷處理的細(xì)胞中,隨著紅景天苷應(yīng)用劑量的增加,細(xì)胞存活率呈下降趨勢,單獨(dú)照射 UVB組與UVB+500μg/ml紅景天苷組有顯著性差異(P<0.05),說明紅景天苷和UVB的聯(lián)合應(yīng)用能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡和壞死,降低細(xì)胞存活率。紅景天苷對(duì) HaCaT細(xì)胞亦有類似的作用。紅景天苷的這種作用使其有可能成為治療和預(yù)防皮膚癌的新藥物。
　　 結(jié)論：
　　 1.UVB誘導(dǎo) Ha

14、CaT細(xì)胞和A431細(xì)胞損傷具有時(shí)間依賴性和劑量依賴性,UVB誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)與細(xì)胞的種類有關(guān),不同種類細(xì)胞對(duì) UVB照射的生物學(xué)反應(yīng)不同。
　　 2.NF—kB信號(hào)通路可能參與UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷應(yīng)答,并與同樣高表達(dá)的Bcl-2、CDK6之間存在一定的聯(lián)系；在A431細(xì)胞中有與 HaCaT細(xì)胞相似的結(jié)果,這些基因和蛋白能夠?yàn)槠つw癌的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 3.紅景天苷聯(lián)合UVB照射能夠降低細(xì)胞存活率,提示紅景天苷具有