TGF-β1和抗CCL20抗體聯(lián)合治療BALB-c哮喘小鼠的療效觀察及初步機制研究.pdf

1、第一部分抗CCL20抗體對哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)的抑制作用
　　目的:觀察趨化因子配體20(CCL20)在小鼠肺組織內(nèi)的表達(dá)情況，探討抗小鼠CCL20單克隆抗體(MCA-CCL20)對哮喘小鼠肺部炎癥和氣道高反應(yīng)的影響。
　　方法:6～8周齡BALB/c小鼠隨機分為4組:哮喘組(OVA)、正常對照組、CCL20單克隆抗體組（單抗組）和治療對照組，每組8只。哮喘組予卵蛋白(OVA)致敏和激發(fā)建立哮喘小鼠模型，單抗組和治療

2、對照組致敏和激發(fā)同哮喘組，但自第一次激發(fā)起，霧化前1h分別腹腔注射MCA-CCL20或磷酸鹽緩沖液(PBS)，連續(xù)5d。正常對照組用PBS替代OVA進行致敏和激發(fā)。末次霧化激發(fā)后24h體描儀測定小鼠氣道反應(yīng)性，HE染色觀察肺組織病理炎癥及程度評分，免疫組化及圖像分析和實時聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)分別測定小鼠肺組織CCL20的蛋白含量和基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果:哮喘組小鼠肺組織切片炎癥浸潤及病理評分、氣道高反應(yīng)、肺

3、組織CCL20mRNA相對表達(dá)量及免疫組化CCL20平均光密度值均顯著高于正常對照組。與哮喘組相比，單抗組小鼠肺部細(xì)胞浸潤減輕(p＜0.05)，肺功能（乙酰甲膽堿濃度為25～50mg/ml時）Penh降低(p＜0.05)，肺組織切片CCL20平均光密度值明顯降低(p＜0.01)，而CCL20mRNA表達(dá)無明顯改變。
　　結(jié)論:CCL20單克隆抗體可改善OVA誘發(fā)的小鼠哮喘炎癥和氣道高反應(yīng)，其抑制作用可能涉及抗鼠CCL20單抗阻斷部

4、分CCL20活性有關(guān)。
　　第二部分 TGF-β1和抗CCL20抗體聯(lián)合治療對BALB/c哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)的療效觀察及初步機制研究
　　目的:探討在TGF-β1和抗CCL20抗體(MCA-CCL20)聯(lián)合干預(yù)對哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)的影響，初步闡述可能的機制。
　　方法:6～8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為5組:哮喘組、對照組、MCA-CCL20干預(yù)組（單抗組）、TGF-β1干預(yù)組和MCA-CCL2

5、0+ TGF-β1干預(yù)組（聯(lián)合組）。哮喘組予卵蛋白(OVA)及佐劑混合物致敏和1％OVA激發(fā)構(gòu)建哮喘小鼠模型。單抗組、TGF-β1干預(yù)組及聯(lián)合組致敏和激發(fā)方法同哮喘組，但自第一次激發(fā)起，單抗組霧化前1h分別腹腔注射MCA-CCL20，連續(xù)5d; TGF-β1干預(yù)組于首次霧化激發(fā)前1h氣管滴入TGF-β1;聯(lián)合組為MCA-CCL20和TGF-β1聯(lián)合干預(yù)。對照組用PBS替代OVA進行致敏和激發(fā)。末次激發(fā)后24h用體描儀行小鼠肺功能檢測，收

6、集BALF，進行細(xì)胞計數(shù)及分類計數(shù)，HE染色觀察肺組織病理炎癥，免疫組化檢測肺組織CCL20、Smad6，Real-time PCR測定小鼠肺勻漿CCL20、Smad6、TGF-β1mRNA表達(dá)及ELISA檢測BALF中TGF-β1、TNF-α和IL-1β含量。
　　結(jié)果:MCA-CCL20干預(yù)OVA誘發(fā)的哮喘小鼠后，肺組織切片CCL20蛋白表達(dá)的陽性顆粒顏色明顯變淺，著色范圍明顯變窄，BALF中IL-1β、TNF-α含量減低(p

7、＜0.01); TGF-β1干預(yù)后，小鼠肺組織Smad6著色分布范圍更廣及顏色明顯加深且Smad6 mRNA呈高表達(dá);TGF-β1與MCA-CCL20聯(lián)合干預(yù)可見上述單獨干預(yù)的所有表現(xiàn)，且BALF中TNF-α下降水平更加顯著。TGF-β1或MCA-CCL20二者單獨干預(yù)后，哮喘小鼠的BALF細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞及嗜酸細(xì)胞計數(shù)比例皆降低，肺部炎性細(xì)胞浸潤減輕，氣道高反應(yīng)降低，肺功能得以改善。TGF-β1與MCA-CCL20聯(lián)合干預(yù)比單獨干預(yù)