納米銅對(duì)豬腎細(xì)胞線粒體凋亡途徑的影響.pdf

1、納米銅作為納米科技迅猛發(fā)展的重要成果，越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)、飼料行業(yè)等畜牧獸醫(yī)相關(guān)領(lǐng)域。在畜牧業(yè)中，銅作為一種促生長(zhǎng)劑被廣泛的使用，但傳統(tǒng)的銅添加劑吸收利用率低，大量銅隨糞便排出，污染了土壤環(huán)境的同時(shí)也造成了極大的浪費(fèi)。而使用納米銅作為飼料添加劑可顯著提高表觀消化率、提高生產(chǎn)性能和機(jī)體免疫力。但伴隨著納米銅高利用率和效能而來(lái)的生物安全性問(wèn)題也逐漸凸顯出來(lái)。研究表明，納米銅的主要靶器官是腎臟和肝臟，反復(fù)經(jīng)口染毒可引起腎臟和肝臟的損傷;

2、離體實(shí)驗(yàn)顯示，培養(yǎng)基中添加過(guò)量的納米銅可以誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化和細(xì)胞器的損傷，同時(shí)納米銅還可以劑量依賴性的誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，并在此過(guò)程中伴隨著線粒體膜電位的改變，線粒體膜電位的改變被看成是細(xì)胞凋亡線粒體途徑（內(nèi)源性途徑）的起始事件，但關(guān)于納米銅與線粒體途徑凋亡關(guān)系的更進(jìn)一步研究尚未發(fā)現(xiàn)報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)就以豬的腎上皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行20、40、60、80μg/mL四種不同劑量納米銅的染毒處理，通過(guò)對(duì)豬腎上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化、凋

3、亡率、線粒體膜電位的變化以及細(xì)胞內(nèi)Bid、Bax、Caspase-3和細(xì)胞色素C的mRNA表達(dá)變化情況的觀察，探討了納米銅和細(xì)胞凋亡的劑量效應(yīng)關(guān)系，以闡述納米銅對(duì)細(xì)胞凋亡中線粒體途徑的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:
　　1.應(yīng)用HE染色、AO/EB雙熒光染色，觀察納米銅對(duì)腎上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，可以觀察到細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞間距增大。從形態(tài)學(xué)角度證實(shí)納米銅能夠引發(fā)腎上皮細(xì)胞的凋亡，且腎上皮細(xì)胞的凋亡指數(shù)與培養(yǎng)基中添加的納米銅劑量呈正相關(guān)。<

4、br>　　2.應(yīng)用FITC-PI染色法，使用流式細(xì)胞術(shù)觀察納米銅對(duì)腎上皮細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果顯示四組細(xì)胞的總凋亡率分別為16.77％、17.04％、25.93％、30.25％。表明培養(yǎng)基中添加不同濃度的培養(yǎng)基均能使細(xì)胞的凋亡率上升，且腎上皮細(xì)胞的凋亡率與培養(yǎng)基中添加的納米銅呈正相關(guān)，證實(shí)了在培養(yǎng)基中添加納米銅能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。
　　3.使用JC染色法，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腎上皮細(xì)胞線粒體膜電位的變化情況，結(jié)果顯示培養(yǎng)基中添加四種不同

5、濃度的納米銅引起細(xì)胞線粒體膜電位變化的百分率分別為8.72％、10.14％、28.43％、57.44％，證實(shí)了納米銅確實(shí)可以引起線粒體膜電位的變化從而影響細(xì)胞的線粒體凋亡途徑。
　　4.應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)在添加納米銅后3、6、12、24h四個(gè)時(shí)間段和20、40、60、80μg/mL四種不同濃度的納米銅對(duì)細(xì)胞線粒體凋亡途徑中關(guān)鍵蛋白Bid、Bax、caspase-3以及細(xì)胞色素C的mRNA表達(dá)量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Bid和

6、Bax基因在40到60μg/mL濃度區(qū)間時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，并且有隨著時(shí)間延長(zhǎng)峰值有前移的趨勢(shì)，揭示了在此濃度區(qū)間內(nèi)，Bid與Bax大量生成并共同作用在線粒體膜上，增大了線粒體膜對(duì)于細(xì)胞色素C的通透性。細(xì)胞色素CmRNA的表達(dá)量在3、6h組中的表達(dá)量隨濃度的增加而增加，在60μg/mL濃度時(shí)達(dá)到最大而在最高濃度80μg/mL時(shí)略微下降;在12、24h組中，峰值前移在40μg/mL濃度時(shí)就達(dá)到最大。Caspase-3的mRNA受時(shí)間影響不大