中藥抗生素牛至油注射亞微乳的制備及藥效學(xué)研究.pdf

1、目的：近年來，臨床上長期濫用抗生素導(dǎo)致的“廣泛耐藥性”、“超級細(xì)菌”等問題對人民生命造成了嚴(yán)重的危害，廣大民眾急盼藥學(xué)工作者能尋找傳統(tǒng)化藥抗生素的替代品，因此新型中藥抗生素的研發(fā)已刻不容緩。牛至油是從植物牛至中提取的揮發(fā)油，為淡黃色油狀液體，世界范圍內(nèi)均有以此為原料的人用藥品和保健品。長期以來，歐美各國把它作為食品的抗菌防腐保鮮劑，也是我國民間常用的中藥和動物飼料添加劑之一，具有安全、高效、綠色等特點。本課題根據(jù)現(xiàn)代中藥制劑的特點和要求

2、，旨在開發(fā)一種能防治由于細(xì)菌引起的感染類疾病的新型中藥綠色抗生素—牛至油注射亞微乳。它與目前市場上相關(guān)制劑相比具有更好的穩(wěn)定性、對消化道無刺激、起效迅速、生物利用度高，該制劑的研發(fā)不但填補了牛至油類注射劑臨床用藥的空白，且藥材原料來源廣泛、無毒性、綠色環(huán)保，是一種非常理想的化藥抗生素替代品，其突出了中藥的優(yōu)勢和特點，開拓了中藥抗生素的發(fā)展方向。
　　方法：（1）以“單因素水平試驗和正交試驗法”考察了牛至揮發(fā)油水蒸汽蒸餾提取工藝，并

3、以結(jié)合“Box-Benhnken響應(yīng)面法”優(yōu)化了牛至揮發(fā)油減壓提取工藝，然后比較2種提取工藝所得揮發(fā)油化學(xué)成分的差異，同時通過“紙片擴(kuò)散法”考察了2種工藝所得揮發(fā)油抗菌性的不同；（2）采用GC-MS法對牛至藥材不同部位（花-葉，莖，根）所得揮發(fā)油的化學(xué)成分和種類進(jìn)行全面的比較與分析，同時結(jié)合“管碟法、DPPH自由基清除率實驗、鐵氰化鉀總還原能力實驗”考察了各部位揮發(fā)油的抗菌性和抗氧化性，為牛至油生物活性的研究提供了實驗依據(jù)；（3）采用G

4、C-MS法考察了7個不同產(chǎn)地牛至藥材所得揮發(fā)油的質(zhì)量差異，測定其中3種成分(香荊芥酚、麝香草酚、對-聚傘花素)的含量，結(jié)合“內(nèi)標(biāo)法”對其中3種成分(香荊芥酚、麝香草酚、對-聚傘花素)的含測方法進(jìn)行方法學(xué)考察，并確定其含量大小；（4）先采用“單因素水平試驗和比較分析法”考察了牛至油的物性參數(shù)（溶解度、相對密度、折光率、電導(dǎo)率、pH值、黏度、δ電勢等），然后采用“正交實驗設(shè)計和Box-Benhnken響應(yīng)面法”考察了處方中注射用油、大豆卵磷

5、脂、泊洛沙姆188的配比及用量，優(yōu)化了牛至油注射亞微乳的處方，最后采用“正交設(shè)計結(jié)合指標(biāo)評價法”確定了牛至油注射亞微乳的制備工藝及滅菌工藝；（5）采用HPLC法對牛至油注射亞微乳中3種成分(香荊芥酚、麝香草酚、對-聚傘花素)的含測方法進(jìn)行了系統(tǒng)適應(yīng)性及方法學(xué)考察，并確定3種成分的含量；（6）采用透射電鏡法、粒徑及粒度分布測定法、葡聚糖凝膠法、鉑金板法等測定了成品乳劑的物性參數(shù)（外觀、粒徑、包封率、表面張力、電導(dǎo)率、pH值、δ電勢等），再

6、通過“穩(wěn)定性試驗、溶血試驗、血管刺激性試驗、MTD和LD50值的測定”考察了成品乳劑的穩(wěn)定性、安全性、刺激性和急性毒性；（7）采用“ELISA試劑法”以大鼠血清中“IL-6、IL-10、TNF-α、CRP”的含量變化為評價指標(biāo)，考察了牛至油注射亞微乳的抗肺炎作用，同時采用“MTT法，小鼠 NK細(xì)胞活性實驗，小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的碳廓清試驗和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗”評價了牛至油提高機(jī)體免疫力的功能；（8）采用“血藥濃度法”考察了牛

7、至油注射亞微乳在健康 SD大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程，并結(jié)合“DAS2.0藥動學(xué)分析軟件”確定了其主要的藥動學(xué)參數(shù)。
　　結(jié)果：（1）水蒸汽蒸餾法提取牛至揮發(fā)油的最佳工藝為：藥材粉碎至粗粉，加10倍量水，浸泡2 h，提取8 h；減壓提取法提取牛至揮發(fā)油的最佳工藝為：液料比10:1，壓強558 mbar，加熱回流4.23 h；兩種方法比較研究表明：水蒸汽蒸餾法和減壓提取法所得揮發(fā)油成分的種類不同（常壓提取法共鑒定出25種成分，減壓提取法鑒

8、定出23種成分），存在一定的差異性，同時麝香草酚和香荊芥酚等抑菌成分，隨著提取壓強的改變呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律，從而影響牛至油的抑菌效果。（2）從各提取部位所得揮發(fā)油的化學(xué)成分來分析，花-葉中最多，根其次，莖中最少，花-葉中鑒定出37個化合物，占揮發(fā)油總量的98.78％；莖中鑒定出11個化合物，占揮發(fā)油總量的99.51%，根中鑒定出29個化合物，占揮發(fā)油總量的98.97%，三種不同提取部位的揮發(fā)油共鑒定出化合物59個，其中3個化合物（香荊芥

9、酚、麝香草酚、石竹素）為共有成分；牛至不同部位所得揮發(fā)油都具有抑菌活性，花-葉油的抑菌活性要強于根油和莖油；各部位揮發(fā)油對DPPH的清除作用為：花-葉油>根油>莖油，各部位揮發(fā)油隨著濃度的增加，還原能力也逐漸增加。當(dāng)濃度小于1.25 mg/mL時，無法判斷哪種揮發(fā)油的還原能力較強，但當(dāng)濃度大于1.25 mg/mL時，各提取部位揮發(fā)油的還原能力出現(xiàn)明顯的差異，還原能力的大小為：花-葉油>根油>莖油。（3）通過綜合比較7個產(chǎn)地的牛至藥材分析

10、發(fā)現(xiàn)，湖北團(tuán)風(fēng)、江西九江、陜西西安3個地區(qū)的牛至藥材品質(zhì)較優(yōu)，其三種成分（香荊芥酚、麝香草酚、對-聚傘花素）的總量>50%；經(jīng)GC-MS分析及內(nèi)標(biāo)法最終確定每1mL牛至揮發(fā)油中含麝香草酚為462.1 mg，香荊芥酚為138.9mg，對-聚傘花素42.4 mg，3種成分的總含量＞600 mg，綜合考慮各產(chǎn)地、環(huán)境、氣候及采收時間的差異，最終確定每1mL牛至揮發(fā)油中含有麝香草酚、香荊芥酚、對-聚傘花素三者總含量不應(yīng)<500 mg。（4）對牛

11、至油的理化性質(zhì)及參數(shù)考察發(fā)現(xiàn)，牛至油脂溶性較強，易溶非極性的醚類、酮類、油脂類及無水乙醇中；常溫下的相對密度為0.9511，具有一定的黏度（3.311±0.018 mPa·s）；常溫下其電導(dǎo)率、δ電勢幾乎0；pH值顯弱酸性，其折光率會隨溫度的升高逐漸增加；對制劑工藝學(xué)優(yōu)化后，確定牛至油注射亞微乳處方為：牛至油1g，大豆卵磷脂1.9 g,泊洛沙姆1882.4 g,注射大豆油（LCT:MCT=1:1）22 g,甘油2 g,油酸0.34 g，

12、BHT0.2 g，注射用水加至100 mL；制備工藝為將油、水兩相在60℃下混合，邊加邊攪拌，然后收集溶液，采用高速剪切機(jī)，檔位調(diào)節(jié)至F檔(19000 r·min-1)，剪切30 min得到初乳；收集初乳并轉(zhuǎn)入高壓均質(zhì)機(jī)中，在1000 bar的壓力下，均質(zhì)10次后，得到終乳，即為成品；牛至油注射亞微乳的滅菌工藝最終確定為：將介質(zhì) pH值調(diào)節(jié)為6～8，采用105℃45 min進(jìn)行濕熱滅菌，即可。（5）牛至油亞微乳中麝香草酚的含量為4.56

13、1 mg/mL；香荊芥酚的含量為1.033 mg/mL；對-聚傘花素的含量為0.185 mg/mL（6）對牛至油亞微乳的性狀、物性參數(shù)、穩(wěn)定性、安全性等考察發(fā)現(xiàn)，成品乳劑的粒子外觀呈球狀，粒徑大小基本一致，粒徑分布均勻，平均粒徑（Z-ave）為135.44±2.66 nm，粒徑分布(PDI)為0.124±0.003，δ電勢為-36.10±1.15 mv，常溫下黏度為12.14×10-3Pa·s，pH=6.43，滲透壓=283 osm·k

14、g-1，各項物性參數(shù)符合相關(guān)要求；穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明：經(jīng)高速離心、冷-熱交替循環(huán)及6個月的長期試驗考察各項物性參數(shù)未見明顯變化；安全性試驗表明成品乳劑無明顯溶血及血管刺激性現(xiàn)象，急毒試驗表明：牛至油亞微乳的半數(shù)致死量(LD50)為1.35 mg/g。（7）藥效試驗研究表明：牛至油亞微乳低劑量給藥組IL-6、IL-10、TNF-α和CRP含量低于模型組，肺炎癥狀得到輕微改善，但與模型組比較并不明顯。牛至油亞微乳中、高劑量組IL-6、IL-

15、10、TNF-α和CRP含量均明顯低于模型組，說明牛至油亞微乳能夠有效地降低各細(xì)胞因子的分泌，有效改善了肺炎癥狀；牛至油提高機(jī)體免疫力試驗結(jié)果表明：牛至油具有明顯提高小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬能力及 NK細(xì)胞活性的作用，同時小鼠的脾臟及胸腺指數(shù)增加明顯，說明牛至油有較強的促動物生長的能力。（8）牛至油注射亞微乳在大鼠體內(nèi)藥物動力學(xué)參數(shù)為：以麝香草酚為指標(biāo)AUC(0-t)=170266.1 ng/L*min， Cmax=7695.175 ng/L

16、，Tmax=5 min，t1/2z=60.013 minCLz=1.184 L/min/kg， Vz=106.973 L/kg，MRT(0-∞)=43.541 min；以香荊芥酚為指標(biāo)AUC(0-t)=72690.93 ng/L*min，Cmax=3132.741 ng/L，Tmax=5 min，t1/2z=55.101 min， CLz=1.499 L/min/kg，Vz=119.186 L/kg，MRT(0-∞)=39.877 mi

17、n，說明牛至油亞微乳在體內(nèi)生物利用度高，起效快，適合靜注給藥。
　　結(jié)論：（1）牛至藥材采用不同的提取工藝，所得揮發(fā)油化學(xué)成分的種類及抗菌性有明顯的差異，減壓提取相比常壓提取所得揮發(fā)油的抗菌性更強，且麝香草酚和香荊芥酚的含量會隨著壓強的改變而發(fā)生規(guī)律性變化，表明不同的提取方法可能會直接影響牛至油的抗菌性；（2）牛至藥材不同部位（花-葉、莖、根）所得揮發(fā)油，均具有抗菌性和抗氧化性，其中牛至藥材的“地下部分“(根)與“地上部分”（花-

18、葉、莖）含有同類抗菌性成分，同時根中還含有大量脂肪酸類化合物（棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸），該類化合物在根部含量極高（相對百分含量大于60%），它們的存在對于發(fā)掘牛至藥材新的藥效作用可能具有一定的意義，故應(yīng)予適當(dāng)保留或開發(fā)；（3）本研究所確定的牛至油亞微乳的處方、制備工藝、滅菌工藝均被證明其實用性強，操作簡單，重現(xiàn)高，所得成品乳劑粒徑較小，粒度分布均勻，表面張力大大降低，δ電勢＜-36 mv，包封率＞85%，穩(wěn)定性強，可推廣于實際生產(chǎn)中；（

19、4）本研究中首次建立了原料藥-牛至油中3種成分（香荊芥酚、麝香草酚、對-聚傘花素）的GC-MS含測方法，同時建立成品乳劑中3種成分（香荊芥酚、麝香草酚、對-聚傘花素）的 HPLC含測方法，結(jié)果表明上述2種方法專屬性強，重現(xiàn)性高，精密度良好，可用于對原料藥（牛至油）及制劑（牛至油亞微乳）的質(zhì)量控制及檢驗；（5）本研究首次通過初步藥效試驗驗證了牛至油具有較好的抗炎和提高機(jī)體免疫力的作用，這與以往的文獻(xiàn)報道是相吻合，其中抗炎作用的發(fā)現(xiàn)為牛至油