人體腸道內(nèi)丁酸鹽產(chǎn)生菌的分離鑒定和功能評(píng)價(jià).pdf

1、近三十年來(lái)，炎癥性腸?。↖nflammatory bowel diseases，IBD）的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)迅速升高，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康和生活質(zhì)量。盡管有研究發(fā)現(xiàn) IBD的發(fā)病表現(xiàn)出一定的家族遺傳特性，也鑒定出160多個(gè)人體基因與IBD相關(guān)，但是IBD發(fā)病率的迅速攀升并不能單純地歸結(jié)于遺傳因素，真正起關(guān)鍵作用的是包括腸道菌群在內(nèi)的環(huán)境因素。已有許多研究發(fā)現(xiàn)IBD患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的重要特征是一些機(jī)會(huì)性致病菌豐度的增多和丁酸鹽產(chǎn)生菌(

2、Butyrate-producing bacteria，BPB)類群的減少。人為將丁酸鹽產(chǎn)生菌回接到IBD患者腸道內(nèi)可能是以菌群為靶點(diǎn)的IBD治療的新的突破口。丁酸鹽產(chǎn)生菌有望成為針對(duì)IBD的新一代的益生菌。
　　然而，丁酸鹽產(chǎn)生菌作為腸道菌群內(nèi)的一個(gè)功能類群，多樣性極為豐富，代謝通路各異，關(guān)鍵功能基因序列也各有特點(diǎn)。人體腸道內(nèi)仍存在大量未被分離培養(yǎng)的丁酸鹽產(chǎn)生菌菌株。目前已被報(bào)道的丁酸鹽產(chǎn)生菌的抗炎作用都還停留在細(xì)胞或動(dòng)物模型，

3、且接種丁酸鹽產(chǎn)生菌后對(duì)宿主菌群結(jié)構(gòu)的影響并未被深入研究。因此，本論文從健康人體內(nèi)分離得到丁酸鹽產(chǎn)生菌，在葡聚糖硫酸鈉（Dextran sulfate sodium,DSS）誘導(dǎo)的腸炎小鼠模型中評(píng)價(jià)不同丁酸鹽產(chǎn)生菌的生理功能，并研究丁酸鹽產(chǎn)生菌對(duì)宿主腸道菌群的調(diào)節(jié)作用及其與宿主健康之間的關(guān)系。
　　首先，本研究利用厭氧培養(yǎng)的方法，從一位健康成年男性志愿者的糞便樣品中分離得到29株BPB候選菌株，并對(duì)其中最近鄰居是典型BPB的3株代表

4、菌株進(jìn)行了詳細(xì)的生理生化特性和形態(tài)學(xué)鑒定，并完成了3株BPB的全基因組測(cè)序和比較基因組學(xué)分析。根據(jù)各自16S rRNA基因的最近鄰居，將三株代表菌株命名為Anaerostipes hadrusBPB5（相似性99.73%）、Eubacteriumsp. BPB21（相似性96.00%）和Eubacterium rectaleBPB22（相似性99.80%），BPB21可能是一個(gè)新的微生物種。三株菌均為嚴(yán)格厭氧菌，在體外YCFAGSC培養(yǎng)

5、基中都產(chǎn)生丁酸和氫氣，但都不大量消耗乙酸，其中BPB5可產(chǎn)生10.81 mM的丁酸，而B(niǎo)PB22的丁酸產(chǎn)量達(dá)到22.44 mM。BPB21形態(tài)奇特，菌體呈絲狀并順時(shí)針相互纏繞，且末端成環(huán)。三株菌中，BPB5的碳源利用譜最廣，能夠特異性地利用蔗糖、山梨糖、甘油和菊粉，其基因組中包含更多數(shù)量的蔗糖和菊粉代謝相關(guān)基因。對(duì)丁酸產(chǎn)生相關(guān)基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，三株BPB的基因組中都包含構(gòu)成至少一條完整丁酸產(chǎn)生通路的多個(gè)相關(guān)基因，其中BPB5和 BPB2

6、2利用丁酰輔酶 A：乙酰輔酶 A轉(zhuǎn)移酶，而 BPB21利用丁酸激酶產(chǎn)生丁酸?；谌蚪M序列的安全性評(píng)估結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三株BPB基因組中均未找到已知的能夠直接對(duì)宿主造成危害的毒力基因，而其他的潛在風(fēng)險(xiǎn)因子（如抗生素抗性基因和基因間插入序列）數(shù)量與典型益生菌類似，并且遠(yuǎn)低于典型病原菌。三株丁酸鹽產(chǎn)生菌可作為益生菌的候選菌株，但生理效應(yīng)還需在動(dòng)物模型中進(jìn)行驗(yàn)證和深入研究。
　　然后，我們利用DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型評(píng)價(jià)了丁酸產(chǎn)生能力較強(qiáng)的

7、兩株人源丁酸鹽產(chǎn)生菌的生理功能。發(fā)現(xiàn)Eubacterium rectale BPB22對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎的恢復(fù)有一定的促進(jìn)作用，而對(duì)健康小鼠無(wú)害的Anaerostipes hadrusBPB5卻能夠顯著加重DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎。實(shí)驗(yàn)中我們?cè)u(píng)價(jià)了小鼠炎癥水平，測(cè)定了腸道內(nèi)丁酸產(chǎn)量，利用高通量測(cè)序的方法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了小鼠疾病發(fā)展過(guò)程中腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，并深入探究了 BPB5與小鼠腸道菌群的相互作用對(duì)于BPB5在兩種狀態(tài)小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出不同生理

8、功能的潛在貢獻(xiàn)。結(jié)果表明，給健康小鼠灌胃BPB5能夠增加動(dòng)物盲腸內(nèi)容物中的丁酸含量，且未觀察到任何有害的現(xiàn)象。但是在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中，灌胃BPB5或BPB22都不能增加小鼠盲腸中的丁酸含量。BPB5反而引起小鼠發(fā)生比單純DSS處理組更嚴(yán)重的體重下降和疾病活動(dòng)指數(shù)上升，并最終導(dǎo)致更高的死亡率；BPB22灌胃組則在DSS停藥后對(duì)小鼠的腸炎癥狀的恢復(fù)有一定的促進(jìn)作用。在健康小鼠體內(nèi)，灌胃BPB5不能引起腸道菌群結(jié)構(gòu)的顯著變化，而在

9、DSS誘導(dǎo)的腸炎小鼠模型中，灌胃BPB5使小鼠菌群結(jié)構(gòu)提前3天向DSS處理引起的重度腸炎特征菌群方向變化。對(duì)83個(gè)響應(yīng)DSS和BPB5處理的關(guān)鍵操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）的共變化網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BPB5與 Akkermansia被劃分到同一個(gè)共變化組（Co-abundance group，CAG）中，且該組的豐度在BPB5灌胃組小鼠中提前3天升高到了DSS處理組7天的水平。Akkerm

10、ansia的豐度與腸炎疾病活動(dòng)指數(shù)顯著正相關(guān)?；诰耆蚪M序列的潛在代謝合作分析結(jié)果表明，BPB5可能通過(guò)為Akkermansia的生長(zhǎng)提供碳源、氨基酸和維生素等13種必需的代謝底物來(lái)促進(jìn)后者的提前快速增殖。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)同一來(lái)源的兩株不同的丁酸鹽產(chǎn)生菌菌株在DSS誘導(dǎo)的腸炎小鼠模型中表現(xiàn)出相反的生理功效。同一株丁酸鹽產(chǎn)生菌對(duì)健康和腸炎動(dòng)物模型的生理指標(biāo)和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響表現(xiàn)出巨大差異，再一次表明腸道菌群在結(jié)腸炎