cmvIL-10的表達(dá)純化及初步功能研究.pdf

1、目的：
　　 本研究通過(guò)表達(dá)純化人巨細(xì)胞病毒編碼的白細(xì)胞介素-10(cmvIL-10)，分析cmvIL-10對(duì)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α及HLA-DR表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究HCMV潛伏-激活感染機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1．重組cmvIL-10的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
　　 分別將重組的cmvIL-10原核表達(dá)質(zhì)粒pMal-c2X-cmvIL-10與人白細(xì)胞介素-10(hIL-10)原核表達(dá)質(zhì)粒

2、pMal-c2X-hIL-10（作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照）轉(zhuǎn)化受體菌E.coliBL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；重組蛋白采用Amylose-resin親和層析柱進(jìn)行初步純化，并用葡聚糖凝膠(SephadexG-75)層析進(jìn)行二次純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定。
　　 2．重組cmvIL-10對(duì)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α的影響
　　 將不同濃度（2ng/ml、10ng/ml和50ng/ml）的重組cmvIL-10和

3、hIL-10分別與經(jīng)PHA刺激的THP-1細(xì)胞作用48h后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清液TNF-α水平，觀察其對(duì)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α的影響。
　　 3．重組cmvIL-10對(duì)THP-1細(xì)胞HLA-DR表達(dá)的影響
　　 將不同濃度（2ng/ml、10ng/ml和50ng/ml）的重組cmvIL-10和hIL-10分別與THP-1細(xì)胞作用48h后，收集THP-1細(xì)胞，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，

4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HLA-DRmRNA表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THP-1細(xì)胞表面HLA-DR分子的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．重組cmvIL-10的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
　　 用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示0.5mmol/LIPTG在37℃誘導(dǎo)5h能最有效地誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)；重組蛋白經(jīng)Amylose-resin親和層析柱初步純化，并用SephadexG-75進(jìn)行二次純化后，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，目

5、的蛋白大小為62.5kDa和62.1kDa，結(jié)果與預(yù)期吻合。
　　 2．重組cmvIL-10對(duì)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α的影響
　　 不同濃度（2ng/m1、10ng/ml和50ng/ml）的重組cmvIL-10和hIL-10分別與經(jīng)PHA刺激的THP-1細(xì)胞作用48h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α的濃度分別為：3.8±0.96pg/ml、1.95±0.51pg/ml、1.6±0.45pg/ml和2.49±0.43pg/

6、ml、1.77±0.38pg/ml、0.98±0.16pg/ml。結(jié)果表明，重組cmvIL-10可抑制THP-1細(xì)胞分泌TNF-α，隨著cmvIL-10濃度的增高，抑制作用增強(qiáng)。
　　 3．重組cmvIL-10對(duì)THP-1細(xì)胞HLA-DRmRNA表達(dá)的影響
　　 不同濃度（2ng/ml、10ng/ml和50ng/ml）的重組cmvIL-10和hIL-10分別與THP-1細(xì)胞作用48h后，THP-1細(xì)胞HLA-DRmRNA

7、相對(duì)表達(dá)量分別為：0.86±0.025、0.76±0.023、0.75±0.017和0.73±0.017、0.61±0.017、0.55±0.015。結(jié)果表明，重組cmvIL-10能下調(diào)THP-1細(xì)胞HLA-DRmRNA的表達(dá)，隨著cmvIL-10濃度的增高，抑制THP-1細(xì)胞HLA-DRmRNA的表達(dá)作用增強(qiáng)。
　　 4．重組cmvIL-10對(duì)THP-1細(xì)胞表面HLA-DR分子表達(dá)的影響
　　 不同濃度（2ng/ml、

8、10ng/ml和50ng/ml）的cmvIL-10和hIL-10重組蛋白分別與THP-1細(xì)胞作用48h后，THP-1細(xì)胞表面HLA-DR分子相對(duì)表達(dá)分別為：11.9％、10.8％、9.2％和11.7％、10.5％、8.6％。結(jié)果表明，重組cmvIL-10下調(diào)THP-1細(xì)胞表面HLA-DR分子的表達(dá)，隨著cmvIL-10濃度的增高，抑制THP-1細(xì)胞表面HLA-DR分子的表達(dá)作用增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)成功表達(dá)并