胚胎肝細胞分化因子—10（ELDF-10）的克隆表達及功能的初步研究.pdf

1、　　為了研究ELDF10基因在DS19細胞中的功能。首先，將ELDF10的編碼區(qū)克隆到真核表達載體pEGFP-N1中，表達融合蛋白。利用Lipofectin法轉(zhuǎn)染到MEL-DS19中，使DS19細胞過表達ELDF10蛋白，觀察是否對腫瘤細胞的增殖和分化有影響，初步探討ELDF10基因在DSλ9細胞中的功能。　　轉(zhuǎn)染的重組真核表達載體和空載體，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定表達抗性克隆?！　∮肦T-PCR方法在mRNA水平檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒、轉(zhuǎn)

2、染空載體和正常腫瘤細胞中ELDF10基因的表達，以在組織中恒定表達的GAPDH為對照，結果轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細胞中ELDF10mRNA表達量增加?！　y定三種細胞的生長曲線，發(fā)現(xiàn)在這三種細胞中，轉(zhuǎn)染空載體的細胞生長速度明顯低于轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和正常的腫瘤細胞，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的生長速度比正常DS19細胞略有增加，說明空載體在腫瘤細胞中表達GFP蛋白對細胞生長有明顯的抑制作用，但與GFP融合表達的重組蛋白對腫瘤細胞有促進增殖作用。　　流式細胞儀檢測

3、細胞周期發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞較轉(zhuǎn)染空載體和正常細胞G1期細胞減少，G2期細胞增多，表明ELDFi0-GFP融合蛋白可以減少細胞增殖周期時間，促進細胞增殖。　　聯(lián)苯胺染色陽性是細胞分化成熟的一個標志，對三種細胞進行聯(lián)苯胺染色，觀察有無血紅蛋白在胞漿中表達，結果均為陰性。說明ELDF10-GFP融合蛋白可能沒有誘導細胞分化作用。　　RT-PCR在mRNA水平檢測β珠蛋白的表達，以GAPDH為對照，結果轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細胞中β珠蛋白的表達