細胞因子誘導(dǎo)肝細胞定向分化作用及丙戊酸提高分化率的研究.pdf

1、間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是屬于中胚層的一類多能干細胞,主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中,以骨髓組織中含量最為豐富,其能夠分化為成骨、軟骨和脂肪,為原始造血干/祖細胞在骨髓微環(huán)境中的生長和分化提供支持。近年研究發(fā)現(xiàn),MSCs具有較高的分化潛能,甚至可以跨越分化為其他胚層來源的細胞,MSCs跨越分化肝細胞已成為該領(lǐng)域的研究熱點之一。本研究重點研究小鼠肝臟損傷條件培養(yǎng)液中誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(m

2、BMSSCs)向肝細胞分化的細胞因子,及組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑丙戊酸(VPA)對人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBMSSCs)向肝細胞分化的促進作用。
　　 第一部分:三種細胞因子誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞分化作用的研究
　　 目的:了解肝損傷條件培養(yǎng)液中FGF-4、HGF和OSM對mBMSSCs定向分化肝細胞的作用。
　　 方法：用成骨細胞和脂肪細胞誘導(dǎo)液誘導(dǎo)mBMSSCs向成骨和脂肪細胞分化。檢測肝損傷小

3、鼠損傷不同時間點肝臟和肝損傷條件培養(yǎng)液中FGF-4、HGF和OSM的動態(tài)表達。用相應(yīng)抗體封閉條件培養(yǎng)液中的FGF-4、HGF和OSM因子作為實驗組,未封閉組作為對照組,誘導(dǎo)mBMSSCs向肝細胞分化。RT-PCR檢測CK19、ALB、CK18和TAT的mRNA表達；免疫熒光檢測AFP和ALB的蛋白表達；ELISA檢測細胞ALB分泌水平；PAS反應(yīng)檢測分化細胞的糖原合成能力。
　　 結(jié)果：成骨細胞誘導(dǎo)液能夠誘導(dǎo)mBMSSCs分化為

4、成骨細胞,脂肪細胞誘導(dǎo)液能誘導(dǎo)mBMSSCs分化為脂肪細胞。小鼠肝臟損傷后FGF-4、HGF和OSM的mRNA及蛋白表達水平均比正常組高。實驗組與對照組相比,分化第10dCK18和分化第20dTAT mRNA的表達在對照組檢測到,而實驗組未檢測到；免疫熒光檢測分化第10dAFP和分化第20dALB蛋白低表達；ELISA檢測分化20d時ALB蛋白分泌量明顯降低；PAS反應(yīng)檢測糖原合成陽性率降低。
　　 結(jié)論：抗體封閉肝損傷條件培養(yǎng)

5、液中FGF-4、HGF和OSM,可明顯抑制mBMSSCs向肝細胞的定向分化,提示FGF-4、HGF和OSM是誘導(dǎo)mBMSSCs向肝細胞分化的重要細胞因子。
　　 第二部分:丙戊酸提高細胞因子誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞分化率的研究
　　 目的:研究組蛋白去乙?；敢种苿┍焖?valproic acid,VPA)對人骨髓間充質(zhì)干細胞(human bone marrow stromal stem cells,hBMSSCs

6、)向肝細胞分化的影響。
　　 方法：利用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)篩選的方法分離成年健康志愿者骨髓中的hBMSSCs。將分離得到的hBMSSCs用5mM的VPA預(yù)處理72h后,按照特定的細胞因子和生長因子組合誘導(dǎo)其向肝細胞分化,未加VPA處理的細胞作為對照組。誘導(dǎo)分化過程中,通過對VPA預(yù)處理組和未處理組細胞形態(tài)、分子和細胞功能檢測,比較兩組細胞的分化程度。利用免疫熒光染色和westernblot方法檢測組蛋白H3和H4的乙?；?。

7、
　　 結(jié)果：與對照組相比,經(jīng)VPA預(yù)處理的hBMSSCs,細胞因子誘導(dǎo)后能分化出形態(tài)更均一的肝樣細胞,肝細胞標志性基因(AFP、ALB的mRNA和蛋白)表達水平更高。VPA處理后能明顯提高分化細胞的肝細胞功能,表現(xiàn)在糖原合成,細胞色素P450活性和細胞尿素生成能力增強。5 mM VPA處理72 h后,細胞組蛋白H3和H4的乙酰化水平與處理前比,明顯提高。
　　 結(jié)論：VPA能夠提高hBMSSCs分化肝細胞的效率,其機理