重組白介素10與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其在肝星狀細(xì)胞內(nèi)的表達(dá).pdf

1、目的：(1)構(gòu)建攜帶白介素10、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及二者融合基因的重組表達(dá)載體并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序;(2)將含白介素10、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及二者融合基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至肝星狀細(xì)胞LX-2內(nèi),并檢測(cè)各組LX-2內(nèi)IL-10和HGF的表達(dá)情況;(3)同時(shí)比較含IL-10、HGF和IL-10-HGF融合基因的表達(dá)載體對(duì)LX-2增殖的影響。
　　方法：分別以含有 IL-10和HGF基因的質(zhì)粒 puc57-IL10、pBluescript II

2、-SK(+)-HGF為模板, PCR擴(kuò)增得到IL-10、HGF的基因片段,與T-載體連接,得到T-HGF,測(cè)序正確后酶切,與雙酶切的表達(dá)載體pcDNA3.1進(jìn)行連接,獲得陽(yáng)性克隆IL-10、HGF的表達(dá)載體pCDNA3.1-IL-10和pCDNA3.1-HGF;采用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增IL-10-HGF的融合基因片段,并亞克隆至表達(dá)載體pcDNA3.1,經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證后獲得含有IL-10-HGF融合基因的表達(dá)載體pcDNA3.1-IL-

3、10-HGF;大量制備各基因的表達(dá)載體以及空載體 pCDNA3.1;將各基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞LX-2,RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中IL-10、HGF基因的轉(zhuǎn)錄情況,Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中IL-10、HGF的蛋白表達(dá)情況,MTT法檢測(cè)24h、48h、96h各組細(xì)胞的增殖情況,分析融合基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖能力的作用。
　　結(jié)果：(1)成功構(gòu)建攜帶白介素10、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及二者融合基因的重組表達(dá)載體 pCDNA3

4、.1-IL-10、pCDNA3.1-HGF和pCDNA3.1-IL-10-HGF;(2) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,各組細(xì)胞中均檢測(cè)到IL-10、HGF基因的轉(zhuǎn)錄,而基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相應(yīng)的目的基因轉(zhuǎn)錄水平有顯著提升,表明轉(zhuǎn)染組中各目的基因表達(dá)增強(qiáng);(3)Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,pCDNA3.1-IL-10轉(zhuǎn)染組和pCDNA3.1-HGF轉(zhuǎn)染組均可檢測(cè)到IL-10和HGF的表達(dá),而pCDNA3.1-IL-10-HGF轉(zhuǎn)染組檢測(cè)

5、的蛋白約為105kD,符合IL-10-HGF蛋白的大小;(4)MTT結(jié)果示,pCDNA3.1-IL-10轉(zhuǎn)染組、pCDNA3.1-HGF轉(zhuǎn)染組和pCDNA3.1-IL-10-HGF轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染后24h、48h、96h較空白對(duì)照組對(duì) LX-2的增殖均有抑制作用(＃P<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),但pCDNA3.1-IL-10-HGF轉(zhuǎn)染組對(duì)LX-2的增殖抑制作用較pCDNA3.1-IL-10轉(zhuǎn)染組、pCDNA3.1-HGF轉(zhuǎn)染組更明顯(*P

6、<0.05、◆P<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),而pCDNA3.1-IL-10轉(zhuǎn)染組和pCDNA3.1-HGF轉(zhuǎn)染組之間無(wú)差異(P>0.05,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。
　　結(jié)論：(1)成功構(gòu)建攜帶白介素10、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及二者融合基因的重組表達(dá)載體pCDNA3.1-IL-10、pCDNA3.1-HGF和pCDNA3.1-IL-10-HGF;(2)攜帶白介素10、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及二者融合基因的重組表達(dá)載體pCDNA3.1-IL-10、p