水中產(chǎn)ESBL大腸埃希菌blaCTX-M耐藥基因轉(zhuǎn)移及在燒傷傷口定殖實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、新型廣譜β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素被廣泛應(yīng)用于臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)，受其高選擇性壓力作用，細(xì)菌產(chǎn)生出一類(lèi)新的β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase，bla)，其水解的底物比廣譜酶更為廣泛，稱(chēng)之為超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum-beta lactamase，ESBL)，它能快速水解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，使得細(xì)菌對(duì)此類(lèi)抗生素具有耐藥性。
　　 ESBL多為腸桿科細(xì)菌產(chǎn)生，包括TEM、SHV、CTX-M和OXA等多個(gè)類(lèi)型，其中

2、CTX-M 型是我國(guó)最為流行的基因型。我國(guó)水體中存在產(chǎn)ESBL菌株，此類(lèi)菌株耐藥基因可在致病菌和條件致病菌之間傳播，如果傷口被水中產(chǎn)ESBL菌株感染，治療將非常困難，這對(duì)從事渡江、渡海作戰(zhàn)部隊(duì)或其他涉水作業(yè)人群構(gòu)成了新的健康危險(xiǎn)。雖然人們對(duì)產(chǎn)ESBL菌株耐藥問(wèn)題關(guān)注已久，但關(guān)于水環(huán)境中產(chǎn)ESBL細(xì)菌擴(kuò)散及危害研究得很少。我室對(duì)長(zhǎng)江水系耐藥菌污染問(wèn)題進(jìn)行了長(zhǎng)期研究，發(fā)現(xiàn)江水中產(chǎn)ESBL 耐熱大腸菌群污染嚴(yán)重，質(zhì)粒攜帶率高，呈多耐藥特點(diǎn)。B

3、la基因主要由質(zhì)粒介導(dǎo)，其中接合性質(zhì)粒占多數(shù)，在bla基因轉(zhuǎn)移中起主導(dǎo)作用，非接合性質(zhì)粒所占比例較小，僅在特定條件下才能實(shí)現(xiàn)bla基因的轉(zhuǎn)移，無(wú)論接合性質(zhì)粒還是非接合性質(zhì)粒，都在bla基因水平轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。我室陳浩證實(shí)產(chǎn)ESBL菌株可通過(guò)飲水途徑將bla基因水平傳遞給小鼠腸道內(nèi)定殖的大腸埃希菌。目前尚無(wú)水中產(chǎn)ESBL菌株在傷口水平轉(zhuǎn)移耐藥基因及定殖方面的報(bào)道。因此，有必要對(duì)水環(huán)境中產(chǎn)ESBL菌株bla基因水平轉(zhuǎn)移及其危害進(jìn)行深入研究和

4、探索。
　　 基于考慮質(zhì)粒在bla基因傳播中所起的重要作用及非產(chǎn)ESBL菌株獲得bla基因后的潛在危害，本課題以產(chǎn)ESBL大腸埃希菌為切入點(diǎn)進(jìn)行研究，分四個(gè)部分，第一部分研究了攜帶可接合性質(zhì)粒的產(chǎn)ESBL大腸埃希菌bla CTX-M基因水平轉(zhuǎn)移的影響因素；第二部分研究了攜帶非接合性質(zhì)粒的產(chǎn)ESBL大腸埃希菌捕獲氨基糖苷類(lèi)修飾酶編碼基因(aminoglycoside modifying enzyme, AME)與bla CTX-M

5、基因水平轉(zhuǎn)移；第三部分觀察了燒傷傷口被產(chǎn)ESBL與非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌混合感染時(shí)的bla CTX-M基因水平轉(zhuǎn)移；第四部分研究了非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌獲得bla CTX-M基因前后在燒傷傷口定殖轉(zhuǎn)移能力。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.水樣采集與菌株的分離鑒定：從長(zhǎng)江和嘉陵江采集水樣，低溫保存，并于4 h內(nèi)將水樣送至實(shí)驗(yàn)室，用濾膜法檢測(cè)菌落總數(shù)、大腸菌群和耐熱大腸菌群；水樣經(jīng)稀釋和過(guò)濾后，用含頭孢噻肟(CTX)的M-FC

6、培養(yǎng)基篩選菌株，挑取藍(lán)色菌落用梅里埃自動(dòng)生化分析儀鑒別菌種；用標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法測(cè)定菌株耐藥譜；用雙紙片法進(jìn)行產(chǎn)ESBL 確證。
　　 2.溫度與pH值對(duì)產(chǎn)ESBL菌株體外接合影響的觀察：將長(zhǎng)江水中2株攜帶接合性質(zhì)粒的產(chǎn)ESBL大腸埃希菌(編號(hào)E. Coli 425和E. Coli 452)與非產(chǎn)ESBL 但對(duì)利福平高度耐藥的E. Coli NK5449 混合接種于LB 液體培養(yǎng)基中，觀察在溫度和pH值兩個(gè)因素對(duì)產(chǎn)ESBL大腸埃希菌

7、bla CTX-M基因轉(zhuǎn)移效率的影響。
　　 3.產(chǎn)ESBL大腸埃希菌對(duì)AME基因的捕獲與bla CTX-M基因轉(zhuǎn)移：將攜帶非接合性質(zhì)粒的2株產(chǎn)ESBL菌株(編號(hào)E. Coli 293和E. Coli 310，產(chǎn)ESBL，對(duì)慶大霉素敏感)與受體菌(編號(hào)E. Coli 295，非產(chǎn)ESBL，攜帶接合性質(zhì)粒，對(duì)慶大霉素耐藥)進(jìn)行接合，形成轉(zhuǎn)移接合子，再次將該轉(zhuǎn)移接合子與E. Coli NK5449 進(jìn)行接合，觀察AME基因捕獲與bl

8、a CTX-M基因水平轉(zhuǎn)移；用PCR 方法檢測(cè)分析供、受體菌與轉(zhuǎn)移接合子受試菌株bla基因型、AME基因及整合子攜帶情況，并用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)判斷相關(guān)菌株同源性。
　　 4.燒傷傷口內(nèi)細(xì)菌耐藥基因水平轉(zhuǎn)移以及與液體中耐藥基因水平轉(zhuǎn)移比較將10只20～22g 雄性BALB/c小鼠均構(gòu)建為深Ⅱ度局部燒傷模型(燒傷位于臀背部，燒傷面積為體表面積的3％)

9、隨機(jī)分為混合感染組(7只)和空白對(duì)照組(3只)。向混合感染組小鼠燒傷區(qū)皮下混合注入菌液，產(chǎn)ESBL的E. Coli 452與非產(chǎn)ESBL的E. Coli NK5449各0.1ml，菌液濃度為1.5×108 CFU/ml；向空白對(duì)照組小鼠燒傷區(qū)皮下注射0.2 ml 滅菌PBS。感染后2 d，取燒傷區(qū)肌組織，稱(chēng)量后制成勻漿，經(jīng)系列稀釋后用含頭孢噻肟(CTX，64 μg/ml)與利福平(RIF，160μg/ml)的M-FC平板篩選轉(zhuǎn)移接合子，

10、用含利福平的(RIF，160μg/ml)M-FC 培養(yǎng)基篩選受體菌，計(jì)算接合頻率，并檢測(cè)轉(zhuǎn)移接合子同源性。將E. Coli 452與E. Coli NK5449在液體培養(yǎng)基中以37 ℃混合培養(yǎng)6 h、18 h和48 h的接合頻率作對(duì)比。
　　 5. 非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌獲得bla CTX-M基因前后在燒傷傷口定殖能力比較 將21只雄性BALB/c 均構(gòu)建為深Ⅱ度局部燒傷模型并隨機(jī)分為3組，分別為：對(duì)照組(3只)；E. Coli

11、 C452(E. Coli 452與E. Coli NK5449 形成的轉(zhuǎn)移接合子)感染組(9只)；E. ColiNK5449 感染組(9只)。分別向感染組小鼠燒傷部位皮下注射受試菌懸液0.2 ml，空白組小鼠以PBS 0.2 ml 行皮下注射。感染后1d、4 d和7 d，每次在各組隨機(jī)取1/3 數(shù)量小鼠脫頸處死，無(wú)菌操作，取燒傷區(qū)皮下的肌組織、空腸上段、肺和肝臟各部分，稱(chēng)重后制成勻漿，經(jīng)系列稀釋后用含頭孢噻肟和利福平的M-FC 培養(yǎng)基

12、篩選E. Coli C452菌株，用含利福平的M-FC 培養(yǎng)基篩選E. Coli NK5449菌株，并用SPSS 18.0分析軟件對(duì)各組的肌肉組織、臟器內(nèi)生長(zhǎng)的菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.水樣檢測(cè)結(jié)果 長(zhǎng)江水樣細(xì)菌污染程度明顯低于其支流嘉陵江，嘉陵江水樣菌落總數(shù)、大腸菌群和耐熱大腸菌等指標(biāo)分別為長(zhǎng)江水樣的11倍、144倍和5倍。實(shí)驗(yàn)所用供體菌bla基因型均為CTX-M 型，表現(xiàn)為多耐藥。
　　

13、 2.溫度與pH值對(duì)菌株接合的影響 E. Coli 425與E. Coli NK5449 發(fā)生接合的頻率隨著溫度的降低而升高，從35 ℃到15 ℃，在pH6.1、pH7.1和pH8.1時(shí)分別升高了16.6倍、33.8倍和6.4倍；在35 ℃和25 ℃條件下，當(dāng)pH值為8.1時(shí)發(fā)生接合的頻率要比pH值為6.1時(shí)高，但在15 ℃時(shí)有所變化，pH值為6.1時(shí)的接合頻率要比pH值為8.1時(shí)高。相同溫度時(shí)，pH7.1最適合于接合的發(fā)生。產(chǎn)ESBL

14、的E. Coli 452與非產(chǎn)ESBL的E. Coli NK5449 接合的頻率隨溫度顯著下降，從35 ℃到15 ℃，當(dāng)pH值為6.1、7.1和8.1時(shí)，其接合頻率分別降低了620倍、3220倍和15999倍。在相同溫度時(shí)，pH7.1最適合接合的發(fā)生。在35 ℃和25 ℃兩個(gè)溫度下，當(dāng)pH值為8.1時(shí)，2株產(chǎn)ESBL大腸埃希菌與受體菌的接合頻率均比pH值為6.1時(shí)高，而在15 ℃時(shí)有所變化，在pH為6.1時(shí)的接合頻率高于pH 8.1時(shí)的

15、接合頻率。
　　 3．產(chǎn)ESBL E. Coli 捕獲AME基因與水平轉(zhuǎn)移bla CTX-M基因菌株攜帶非接合性質(zhì)粒，可作為受體菌與攜帶AME基因的非產(chǎn)ESBL 供體菌接合，接合頻率分別為1.6×10-6和7.2×10-6。借助外來(lái)可移動(dòng)基因元件，其本身又可轉(zhuǎn)變?yōu)楣w菌，將blaCTX-M基因向其他受體菌水平轉(zhuǎn)移，接合頻率分別為3.7×10-6和7.4×10-6。經(jīng)過(guò)對(duì)菌株攜帶的Ⅰ類(lèi)整合子可變區(qū)測(cè)序并用Blastn 比對(duì)，Ⅰ類(lèi)整

16、合子可變區(qū)不含bla CTX-M基因。E. Coli 293+295+NK5449、E. Coli 310+295+NK5449的質(zhì)粒與E. Coli 295+NK5449的質(zhì)粒一致，而與E. Coli 293和E. Coli 310所攜帶的質(zhì)粒有明顯差異。
　　 4.燒傷傷口內(nèi)細(xì)菌bla CTX-M基因水平轉(zhuǎn)移 產(chǎn)ESBL E. Coli 452與非產(chǎn)ESBL E.Coli NK5449 混合感染傷口2 d后，在7只小鼠燒傷區(qū)

17、肌組織內(nèi)均篩選出了轉(zhuǎn)移接合子，經(jīng)檢測(cè)與E. Coli NK5449 同源，雙紙片法確證為產(chǎn)ESBL菌株，bla基因型為CTX-M，接合的頻率為(3.0±0.8)×10-1，最低為2.0×10-1，最高達(dá)到4.3×10-1。對(duì)照組未培養(yǎng)出菌落。
　　 5. 非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌獲得bla CTX-M基因前后在燒傷傷口定殖能力比較 E.Coli NK5449和E. Coli C452兩個(gè)感染組，在感染后1d，肝臟和空腸上段組織培養(yǎng)

18、全部為陽(yáng)性，其中以空腸上段定殖感染菌的數(shù)量最多，分別達(dá)到 2.6×105 CFU/g組織和2.7×105 CFU/g組織。在感染后4 d，肝臟和空腸上段組織菌落培養(yǎng)均為陰性。兩組感染菌對(duì)燒傷小鼠模型傷口的定殖能力和向其他臟器轉(zhuǎn)移的能力沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。感染4 d及7 d，以上2組小鼠臟器內(nèi)均無(wú)感染菌的檢出。肺臟則始終無(wú)感染菌的檢出?？瞻讓?duì)照組臟器無(wú)菌落生長(zhǎng)。
　　 結(jié)論
　　 水的溫度和pH值對(duì)產(chǎn)ESBL大腸埃希菌bla

19、CTX-M基因轉(zhuǎn)移中有重要影響，在pH值方面，接近中性的環(huán)境最適于接合的發(fā)生。水溫對(duì)不同菌株其影響效果截然相反，某些產(chǎn)ESBL大腸埃希菌的接合頻率在溫度升高時(shí)，接合頻率上升，另一些產(chǎn)ESBL大腸埃希菌接合頻率卻隨著溫度降低反而升高。雖然接合頻率在自然情況下會(huì)有所降低，但長(zhǎng)江水質(zhì)pH值為7.1～8.3，水溫11～26 ℃，仍適合于bla基因水平轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
　　 與攜帶接合性質(zhì)粒的產(chǎn)ESBL大腸埃希菌相比，攜有非接合性質(zhì)粒的產(chǎn)ES

20、BL大腸埃希菌缺失bla CTX-M基因轉(zhuǎn)移能力是暫時(shí)的，當(dāng)有外來(lái)接合質(zhì)粒、整合子或其他可移動(dòng)基因元件協(xié)助時(shí)，該類(lèi)菌株可以實(shí)現(xiàn)對(duì)其他耐藥基因的捕獲與bla基因的轉(zhuǎn)移，攜帶非接合質(zhì)粒的產(chǎn)ESBL大腸埃希菌，可以通過(guò)接合方式捕獲其他耐藥基因，如AME基因，并將bla基因轉(zhuǎn)移到外來(lái)可接合性質(zhì)粒上，實(shí)現(xiàn)水平轉(zhuǎn)移，由于這個(gè)過(guò)程無(wú)法用接合性質(zhì)粒誘動(dòng)、Ⅰ類(lèi)整合子主動(dòng)捕獲以及現(xiàn)有轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)運(yùn)予以解釋?zhuān)茰y(cè)可能存在其他轉(zhuǎn)移方式。
　　 通過(guò)構(gòu)建小鼠

21、燒傷感染模型，觀察到燒傷傷口混合感染時(shí)菌株間可以實(shí)現(xiàn)blaCTX-M基因水平轉(zhuǎn)移，其接合頻率與體外接合6 h的接合頻率相當(dāng)，但低于體外接合48 h時(shí)的接合頻率，這對(duì)不同細(xì)菌混合感染也有參考意義；在本實(shí)驗(yàn)條件下，非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌獲得水源性產(chǎn)ESBL菌株bla CTX-M基因前后，在燒傷傷口定殖與轉(zhuǎn)移方面沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明受體菌在僅獲得bla CTX-M基因時(shí)，除耐藥譜擴(kuò)大外，其定殖和轉(zhuǎn)移能力不會(huì)發(fā)生明顯變化。
　　 本研究

22、的創(chuàng)新點(diǎn)
　　 1.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，某些產(chǎn)ESBL大腸埃希菌在較低的環(huán)境溫度下，其接合頻率反而升高，這在之前的文獻(xiàn)中沒(méi)有報(bào)道過(guò)，雖然機(jī)制尚不清楚，但足以說(shuō)明bla基因轉(zhuǎn)移的廣泛性與復(fù)雜性。
　　 2.在攜有非接合性質(zhì)粒的產(chǎn)ESBL大腸埃希菌接合實(shí)驗(yàn)中，觀察到了其對(duì)AME基因捕獲與bla CTX-M基因轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移機(jī)制不同于接合性質(zhì)粒的誘動(dòng)，也排除了Ⅰ類(lèi)整合子、常見(jiàn)轉(zhuǎn)座子和插入序列作用，因此推斷可能存在其他轉(zhuǎn)移方式。
　　

23、 3.在燒傷模型傷口內(nèi)觀察到了bla CTX-M基因向受體菌水平轉(zhuǎn)移，這未見(jiàn)在文獻(xiàn)中報(bào)道，其意義在于，被多細(xì)菌感染的傷口在處理不當(dāng)或延遲的情況下，可能造成blaCTX-M基因迅速向其他條件致病菌或致病菌轉(zhuǎn)移，治療難度隨之增加。
　　 4.對(duì)受體菌獲得bla CTX-M基因前后在燒傷模型傷口定殖與轉(zhuǎn)移能力比較中，雖然未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但觀察到感染菌向臟器轉(zhuǎn)移，且以腸道組織內(nèi)濃度最高。在機(jī)體受到嚴(yán)重感染或創(chuàng)傷時(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的燒傷傷口細(xì)

24、菌遷移現(xiàn)象可能與腸道菌遷移現(xiàn)象同時(shí)存在，這兩種遷移途徑在臨床治療與預(yù)防中應(yīng)同時(shí)受到重視。
　　 實(shí)驗(yàn)中存在的不足
　　 1.本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象僅涉及到了長(zhǎng)江和嘉陵江水中的產(chǎn)ESBL大腸埃希菌，而江水中還存在肺炎克雷伯菌、鮑氏不動(dòng)桿菌等產(chǎn)ESBL菌株，它們均可攜帶耐藥質(zhì)粒，因此需擴(kuò)大研究范圍。
　　 2.除pH值和溫度兩個(gè)重要因素外，還應(yīng)考慮到水體β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素殘留、流速、營(yíng)養(yǎng)、濁度以及其他理化因素的影響。

25、>　　 3.定殖于燒傷小鼠傷口內(nèi)的產(chǎn)ESBL大腸埃希菌可將bla CTX-M基因水平傳遞給非產(chǎn)ESBL大腸埃希菌。由于傷口類(lèi)型較多，傷情各有特點(diǎn)，對(duì)傷口內(nèi)bla CTX-M基因轉(zhuǎn)移研究還需深入，如增加切割傷、化學(xué)燒傷等的研究，以得到有共性的結(jié)論。
　　 展望
　　 1.在研究水環(huán)境產(chǎn)ESBL菌株耐藥基因水平轉(zhuǎn)移問(wèn)題時(shí)，增加水中β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素殘留濃度、流速、營(yíng)養(yǎng)條件及其他理化因素，構(gòu)建bla基因水平轉(zhuǎn)移數(shù)學(xué)模型以預(yù)測(cè)