參附注射液在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用和機(jī)制.pdf

1、目的：
　　肝缺血再灌注損傷(liver ischemia/reperfusion injury,liver I/R injury)指機(jī)體在肝臟嚴(yán)重創(chuàng)傷、肝移植、肝臟腫瘤切除、失血性休克等臨床情況下，肝臟組織缺血一段時(shí)間后血流重新恢復(fù)，損傷會(huì)進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。在肝臟I/R損傷過(guò)程中微循環(huán)障礙發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，缺血再灌注損傷的重要原因是微循環(huán)紊亂和肝竇“無(wú)復(fù)流”現(xiàn)象。
　　參與肝臟I/R損傷的細(xì)胞因子主要有干擾素-γ（IF

2、N-γ）、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、IL-12、IL-10、IL-6等，其中有關(guān)TNF-α和IL-1β的報(bào)道較多。由Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α，能夠刺激單核巨噬細(xì)胞和其它細(xì)胞分泌IL-6等炎性因子，激活中性粒細(xì)胞釋放氧自由基，增加肝臟損傷;同時(shí)可以直接引起肝竇內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的相互作用導(dǎo)致肝臟微循環(huán)障礙。由Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β，能夠增強(qiáng)肝臟CXC趨化因子的合成，促

3、進(jìn)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基，上調(diào)中性粒細(xì)胞粘附分子-1，刺激TNF-α的產(chǎn)生，促進(jìn)這些細(xì)胞在肝臟脈管系統(tǒng)內(nèi)聚集。另外IL-1β與TNF-α協(xié)同作用，破壞內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架，誘導(dǎo)合成凝血酶和纖維蛋白酶，加重肝臟損傷。
　　參附注射液(SF injection)是臨床常用的一種抗休克中藥復(fù)方制劑，來(lái)自于《婦人良方》中的參附湯，由人參、附子提取物組成，其有效成分主要為人參皂苷和烏頭類(lèi)生物堿，人參皂苷具有抗應(yīng)激、抗氧化、抗心肌缺血等作用，烏

4、頭類(lèi)生物堿具有強(qiáng)心、擴(kuò)張外周血管、降低外周阻力的作用。文獻(xiàn)報(bào)道在肝I/R時(shí)預(yù)防性應(yīng)用SF可通過(guò)抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)在肝組織中的表達(dá)，減少NO的過(guò)量生成，繼而減少過(guò)氧亞硝酸陰離子(ONOO-)的合成，減輕細(xì)胞毒性，從而起到對(duì)肝臟的保護(hù)作用。在移植肝的保存過(guò)程，SF可通過(guò)升高超氧化物歧化酶(SOD)、NO和降低ET-1、TNF-α、IL-1起到對(duì)移植物的保護(hù)作用。但參附注射液在肝I/R損傷中的作用和機(jī)制尚不完全清楚。本文旨在研

5、究參附注射液對(duì)肝缺血再灌注損傷大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等肝功能指標(biāo)及炎性因子TNF-α、IL-1β的影響，以及對(duì)肝臟微循環(huán)的影響，探討參附注射液在肝I/R損傷中的作用及可能的機(jī)制。
　　材料和方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組
　　健康Wistar大鼠54只，雄性，體重200-250g，隨機(jī)分為3組：(1)假手術(shù)組(Sham組，n=18);(2)缺血再灌注模型組（I/R組，n=18

6、）;(3)參附注射液處理組（SF組，n=18）;各組又分再灌注1h、6h、24h3個(gè)時(shí)間點(diǎn)。
　　2、肝缺血再灌注模型的制備
　　術(shù)前12小時(shí)自由飲水，禁食。稱重后，腹腔注射3.5ml/kg10％水合氯醛溶液麻醉，大鼠平臥于鼠臺(tái)上，腹部及右股部備皮碘伏消毒，右股部游離顯示股靜脈，應(yīng)用頭皮針行股靜脈插管，并連接三通管，三通管一端空置，另一端連接備有10ml生理鹽水的注射器。腹部參照Pringle's法建立I/R模型：腹中線切口

7、進(jìn)腹，顯露肝門(mén)，離斷肝周韌帶，血管夾鉗夾肝十二指腸韌帶，阻斷肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈及膽管。阻斷肝門(mén)15min后，去除肝十二指腸韌帶血管夾，制成肝臟缺血再灌注模型。
　　3、股靜脈注射參附注射液
　　參附注射液組于再灌注同時(shí)三通管側(cè)口處?kù)o推參附注射液2ml/kg，注射器推注補(bǔ)充生理鹽水至總?cè)胍毫?ml，I/R組不注射參附注射液，僅推注生理鹽水2ml，再灌注1h、6h或24h后各組行超聲造影檢查，Sham組步驟與I/R組相同，但不進(jìn)行肝

8、動(dòng)脈、門(mén)靜脈及膽管阻斷。標(biāo)本留取為：切除的肝臟組織，蠟塊保存;下腔靜脈采血2ml，離心后血清于-80℃保存。
　　4、超聲造影（contrast enhanced ultrasound，CEUS）觀察肝臟微循環(huán)狀態(tài)。
　　應(yīng)用德國(guó)Siemens Acuson Sequoia512彩色超聲診斷儀，采用腔內(nèi)探頭，探頭型號(hào)EV8C4-S，進(jìn)入造影模式，由三通管側(cè)口團(tuán)注造影劑0.06ml，應(yīng)用生理鹽水1.5ml沖管，實(shí)時(shí)觀察肝臟微循

9、環(huán)狀態(tài)，并對(duì)圖像進(jìn)行動(dòng)態(tài)存儲(chǔ)，其后對(duì)存儲(chǔ)的圖像進(jìn)行ACQ曲線分析，并記錄峰值強(qiáng)度PI（為造影劑所能達(dá)到的最高強(qiáng)度與基礎(chǔ)強(qiáng)度之間的差值）。
　　5、HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化
　　大鼠肝切片行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察比較各組肝組織的病理學(xué)變化。按美國(guó)匹茲堡大學(xué)器官移植研究所標(biāo)準(zhǔn)將肝缺血再灌注損傷分為輕度和重度兩級(jí)。輕度表現(xiàn)為肝小葉Ⅲ帶肝細(xì)胞水腫、小泡性脂肪變、點(diǎn)狀壞死，毛細(xì)膽管內(nèi)淤膽;門(mén)管區(qū)無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。重度表現(xiàn)為橋接

10、壞死，網(wǎng)狀支架塌陷，中央靜脈周?chē)鲅匝?，小膽管增生，膽汁淤積;門(mén)管區(qū)擴(kuò)大伴有中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　6、應(yīng)用賴氏法測(cè)量血清中ALT、AST含量。
　　7、應(yīng)用Elisa法測(cè)定血清中TNF-α、IL-1β含量。
　　8、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　

11、1、超聲造影結(jié)果
　　再灌注1h、6h、24h缺血再灌注組均較假手術(shù)組PI值降低（再灌注1h P＜0.05，再灌注6h、24h P＜0.01）。再灌注1h及24h參附注射液組與缺血再灌注組間PI值無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，再灌注6h參附注射液組較缺血再灌注組PI值升高(P＜0.01)。
　　2、HE染色結(jié)果
　　光鏡下觀察：再灌注1h缺血再灌注組多為輕度損傷，表現(xiàn)為肝細(xì)胞空泡樣變，部分雖表現(xiàn)為重度損傷，但僅出現(xiàn)匯管

12、區(qū)輕度炎癥，參附注射液組也多為輕度損傷，表現(xiàn)為胞漿空泡樣變和（或）肝細(xì)胞點(diǎn)灶樣壞死，兩組損傷程度差別不明顯;再灌注6h缺血再灌注組多為重度損傷，表現(xiàn)為肝竇充血，擴(kuò)張，匯管區(qū)中重度炎癥，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分甚至出現(xiàn)大片狀肝細(xì)胞壞死，參附注射液組多為重度損傷，但較缺血再灌注組輕，多表現(xiàn)為肝細(xì)胞空泡樣變，匯管區(qū)炎癥，出血，參附注射液組較缺血再灌注組損傷程度明顯減輕;再灌注24h缺血再灌注組多為重度損傷，但較輕，表現(xiàn)為肝細(xì)胞灶性壞死，匯管區(qū)中度

13、炎癥，出現(xiàn)大量的肝細(xì)胞再生，參附注射液組多為輕度損傷，表現(xiàn)為點(diǎn)灶樣壞死，亦出現(xiàn)大量肝細(xì)胞再生。
　　3、血清ALT、AST含量
　　(1)血清ALT含量
　　再灌注1h、6h、24h缺血再灌注組均較假手術(shù)組血清ALT含量升高(P均＜0.01)。再灌注1h參附注射液組較缺血再灌注組血清ALT含量降低(P＜0.05)，再灌注6h、24h參附注射液組與缺血再灌注組間血清ALT含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　(2

14、)血清AST含量
　　再灌注1h缺血再灌注組與假手術(shù)組間血清AST含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，再灌注6h、24h缺血再灌注組較假手術(shù)組血清AST含量升高(P＜0.01)。再灌注1h、24h參附注射液組與缺血再灌注組間血清AST含量無(wú)顯著性差異（P＞0.05），再灌注6h參附注射液組較缺血再灌注組血清AST含量降低(P＜0.01)。
　　4、血清TNF-α、IL-1β含量
　　(1)血清TNF-α含量
　　再

15、灌注1h缺血再灌注組較假手術(shù)組血清TNF-α含量升高(P＜0.05)，再灌注6h、24h缺血再灌注組與假手術(shù)組間血清TNF-α含量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。再灌注1h參附注射液組較缺血再灌注組血清TNF-α含量降低(P＜0.05)，再灌注6h、24h組參附注射液組與缺血再灌注組間血清TNF-α含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　(2)血清IL-1β含量
　　再灌注1h、6h、24h缺血再灌注組均較假手術(shù)組血清IL-1

16、β含量升高（再灌注6h P＜0.05，再灌注1h、24h P＜0.01）。再灌注1h參附注射液組較缺血再灌注組血清IL-1β含量降低(P＜0.01)。再灌注6h、24h參附注射液組與缺血再灌注組間血清IL-1β含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、肝臟缺血再灌注時(shí)微循環(huán)狀態(tài)可以通過(guò)超聲造影實(shí)時(shí)觀察，并能量化。
　　2、肝臟缺血再灌注引起肝微循環(huán)障礙，參附注射液可改善肝微循環(huán)，減輕缺血再灌注損傷。