產(chǎn)EPA-DHA北極細(xì)菌的篩選及其聚酮合酶途徑的研究.pdf

1、ω-3超長鏈多不飽和脂肪酸（VLC-PUFAs），特別是二十碳五烯酸（EPA）及二十二碳六烯酸（DHA）對人體健康具有重要的生理作用。魚油是這些??-3 VLC-PUFAs的主要商業(yè)來源，然而由于污染加重及產(chǎn)量有限，已經(jīng)無法滿足不斷增長的市場需求，微藻和海洋細(xì)菌已成為?-3 VLC-PUFAs的重要替代來源。目前通過隱甲藻和裂殖壺菌合成DHA的產(chǎn)品已經(jīng)進(jìn)入市場，但尚無EPA商業(yè)化產(chǎn)品，且針對海洋細(xì)菌來源的ω-3 VLC-PUFAs的研究

2、相對較少。本研究擬以北極環(huán)境中分離到的海洋細(xì)菌為研究對象，大規(guī)模篩選高效合成 EPA的菌株，同時(shí)重點(diǎn)揭示一株海洋細(xì)菌通過獨(dú)特的聚酮酶合成途徑（PKS）合成DHA的機(jī)制。
　　首先，以采自北極地區(qū)的176株細(xì)菌為材料，結(jié)合 TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）顯色反應(yīng)和氣相色譜（GC）初步篩選產(chǎn) EPA的菌株，再通過氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）確定終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示4株菌能夠合成EPA，經(jīng)16S rDNA鑒定，依次為 Nocardio

3、ides plantarum、Compostimonas suwonensis、Flavobacterium omnivorum和Shewanella baltica，其中Nocardioides和Compostimonas種屬尚未有報(bào)道產(chǎn)EPA的菌株。此外，編號6-42（Shewanella baltica）的菌株合成的EPA占總脂肪酸百分比含量最高，達(dá)到4.9％。因此，我們進(jìn)一步研究了溫度和淺藍(lán)菌素等培養(yǎng)條件對S.baltica6-

4、42菌株EPA含量的影響。在0℃條件下培養(yǎng)，S.baltica6-42菌株的EPA含量達(dá)8.8%，相比10℃條件下培養(yǎng)，EPA含量提高了1.5倍；10℃下加入3μg/mL的淺藍(lán)菌素后，其EPA含量達(dá)7.6%，是未加淺藍(lán)菌素時(shí)的1.6倍；最終，在0℃下加入3μg/mL的淺藍(lán)菌素靜置培養(yǎng)，其EPA含量為11.5%，相比初始的4.9%增加了2.4倍。全基因組測序結(jié)果顯示，S.baltica6-42基因組大小為5.1 Mb、GC含量為41.67

5、%，共有4597個(gè)編碼基因，占基因組大小的84.35%。將編碼基因的氨基酸序列與COG、KEGG、GO等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與各大代謝通路。我們重點(diǎn)關(guān)注參與 EPA合成的PKS途徑中五個(gè)基因，整個(gè)基因簇大小為18954bp。遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)S.baltica6-42的pfa基因簇中PfaABCD蛋白序列保守性較高，而PfaE與其他Shewanella的對應(yīng)蛋白序列差異明顯。此外，將S.baltica6-42與同種屬的S.b

6、altica OS155和S.baltica OS678進(jìn)行基因組共線性分析，發(fā)現(xiàn)S.baltica6-42與兩個(gè)同種屬的菌株在進(jìn)化過程中基因組結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。
　　其次，對一株北極來源的Colwellia psychrerythraea34H合成DHA的機(jī)制進(jìn)行了研究。通過基因組比對，發(fā)現(xiàn)C.psychrerythraea34H中存在編碼DHA合成的關(guān)鍵基因簇（pfaEABCD），全長約為20 Kb。經(jīng)高保真長片段PCR擴(kuò)

7、增獲得pfaE和pfaABCD片段后構(gòu)建重組質(zhì)粒，分別命名為pSTV28::pfaE(DHA)和pDHAΔpfaE。含pSTV28::pfaE(DHA)和pDHAΔpfaE雙質(zhì)粒的DH5?可合成DHA，15℃下培養(yǎng)含量達(dá)3.4%，而僅含pDHAΔpfaE質(zhì)粒的重組菌株不產(chǎn)DHA。隨后構(gòu)建來源于產(chǎn)DHA、EPA、ARA（二十碳四烯酸）菌株的pfaE重組質(zhì)粒，依次標(biāo)記為pfaE（DHA-M）、pfaE（EPA）和pfaE（ARA）。將不同來

8、源的pfaE與C.psychrerythraea34H的pfaABCD共表達(dá)，均可合成DHA且pfaE（EPA）組合的重組菌株DHA含量最高，15℃下DHA含量達(dá)3.7%。進(jìn)一步研究了溫度和淺藍(lán)菌素對重組菌株合成 DHA的影響，結(jié)果表明低溫有利于 DHA的積累，10℃時(shí)pfaE（EPA）重組菌株DHA含量最高，達(dá)到4.1%，是20℃時(shí)DHA產(chǎn)量的13.7倍。加入一定濃度淺藍(lán)菌素可促進(jìn)重組菌株合成DHA。當(dāng)加入2μg/mL的淺藍(lán)菌素到培養(yǎng)