基于核酸模板的銀納米簇合成及腫瘤標(biāo)志物檢測研究.pdf

1、近年，由幾個至幾十個原子組成的銀納米簇因其優(yōu)異的光譜和光物理性質(zhì)而備受科學(xué)家門的關(guān)注。銀納米簇的尺寸一般小于2nm，接近電子的費米波長。當(dāng)金屬納米顆粒的尺寸接近電子的費米波長時，納米顆粒連續(xù)的能帶將分離成多個獨立的能級，展示出許多類分子特性，例如強熒光性，可作為一種熒光信號源用于生化檢測。以DNA為模板合成的銀納米簇往往具有較高的熒光量子產(chǎn)率，可以作為一種新型免標(biāo)記熒光探針用于化學(xué)傳感和生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域。之前的研究表明，這種銀納米簇的穩(wěn)

2、定性和熒光特性與其DNA模板序列密切相關(guān)，且熒光量子產(chǎn)率大多小于0.40。本論文以易形成分子間i-motif結(jié)構(gòu)的核酸序列為模板制備銀納米簇，首先通過設(shè)計模板序列中間loop區(qū)域堿基組成和i-motif結(jié)構(gòu)的母核個數(shù)，篩選出能夠制備高熒光量子產(chǎn)率銀簇的優(yōu)質(zhì)DNA模板;然后，利用獲得的優(yōu)質(zhì)DNA模板結(jié)合適配體對目標(biāo)分析物的特異識別能力，設(shè)計一種特異識別高表達MUC1蛋白的MCF-7乳腺癌細胞的熒光銀納米簇探針，用于乳腺癌細胞成像研究;最后

3、，為了降低銀納米簇對模板序列的依賴性，提出一種新的通用模板設(shè)計策略，不僅使其合成的銀納米簇始終保持高熒光量子產(chǎn)率，還能針對待測物的核酸分子序列，靈活設(shè)計分子識別探針，用于癌基因的檢測。論文工作取得了如下主要成果:
　　(1)、基于分子間i-motif結(jié)構(gòu)模板的銀納米簇制備
　　通過變換分子間i-motif結(jié)構(gòu)中母核的個數(shù)和環(huán)堿基序列，設(shè)計出5組DNA小文庫(每個小文庫包含16條DNA，共80條DNA)，利用DNA小文庫為模板

4、制備出熒光發(fā)射范圍在525-660nm之間的熒光銀納米簇。并獲得一些可以合成高熒光量子產(chǎn)率銀納米簇的DNA模板，其中由序列C4-ATAT-C4、C4-AAAT-C4、C4-AAAA-C3和C4-AAAT-C3穩(wěn)定的銀納米簇發(fā)射紅色熒光，量子產(chǎn)率分別達到0.78、0.48、0.56和0.75;經(jīng)序列C4-ATAT-C3、C3-TATA-C4和C4-ATAA-C3穩(wěn)定的銀納米簇發(fā)射綠色熒光，量子產(chǎn)率分別為0.45、0.41和0.44。研究結(jié)

5、果表明銀納米簇的熒光性質(zhì)受到i-motif結(jié)構(gòu)中母核的個數(shù)和環(huán)堿基序列的調(diào)控，母核個數(shù)為3個時，i-motif結(jié)構(gòu)模板合成的銀納米簇主要發(fā)射綠色熒光，隨著母核個數(shù)的增加，合成的銀納米簇的發(fā)射波長整體紅移。以C4-X1X2X3X4-C4為模板，分析了i-motif結(jié)構(gòu)中的loop區(qū)域堿基序列的堿基組成和排列對銀納米簇?zé)晒獾挠绊?，發(fā)現(xiàn)模板i-motif結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與其形成銀納米簇的量子產(chǎn)率密切相關(guān)。
　　(2)、用于MCF-7乳腺癌細

6、胞成像的銀簇-核酸適配體探針設(shè)計
　　從獲得的制備高熒光量子產(chǎn)率銀納米簇的DNA模板中選擇四條作為成簇序列，通過連接臂與MUC1適配體連接設(shè)計出DNA探針。四條成簇序列為C4-AAAA-C3、C4-ATAT-C3、C4-AAAT-C3和C4-ATAT-C4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有模板C4-AAAA-C3在與MUC1適配體連接后獲得的銀簇探針可以保留其高熒光量子產(chǎn)率，其余三種成簇模板設(shè)計的DNA探針合成的銀納米簇的熒光強度顯著下降，下降幅度在

7、80％以上，說明MUC1適配體序列與成簇模板序列的結(jié)合會對銀簇的制備產(chǎn)生極大影響。結(jié)合MUC1核酸適體的模板序列（C4A4C3-A5-MUC1）所合成的銀簇可以從A549肺癌細胞、MDAMB-231乳腺癌細胞和M+CF-7乳腺癌癥細胞中特異性地識別具有高表達MUC1蛋白的MCF-7乳腺癌細胞。
　　(3)、用于制備高熒光量子產(chǎn)率銀納米簇的通用模板設(shè)計策略
　　提出了一種通用模板策略，用于合成高熒光量子產(chǎn)率的銀納米簇。這種通用

8、模板主要由三段功能序列組成:由含有胞嘧啶序列構(gòu)成的成簇序列，由腺嘌呤或胸腺嘧啶構(gòu)成的中間連接片段，由富G序列組成的熒光增強序列。在給定的條件下設(shè)計通用模板，合成的銀納米簇可發(fā)出明亮的紅色熒光，熒光量子產(chǎn)率均可達0.60以上，其中C4-ATAT-G15穩(wěn)定的銀納米簇的熒光量子產(chǎn)率最高，為0.91。
　　(4)、基于通用模板的銀納米簇探針設(shè)計及其核酸檢測應(yīng)用
　　以通用模板的成簇序列為目標(biāo)識別片段設(shè)計銀納米簇探針:當(dāng)目標(biāo)序列與成

9、簇序列雜交后，無法形成銀簇;當(dāng)溶液中沒有目標(biāo)待測物時，基于通用模板的成簇序列可以合成高熒光量子產(chǎn)率的銀簇。以此為生物傳感原理，將成簇序列設(shè)計成與G-四聯(lián)體完全互補配對，獲得檢測胃腸道腫瘤c-kit基因的熒光銀納米簇探針，檢測限為0.6nM。同時，我們以通用模板中富G序列為基礎(chǔ)設(shè)計識別探針，其與目標(biāo)序列雜交形成雙鏈后使得銀納米簇的熒光迅速衰減，以此原理檢測胃癌BCL單堿基突變基因（富含胞嘧啶，能形成i-motif結(jié)構(gòu)），檢測限為0.8nM