四物湯與Caco-2細(xì)胞外排轉(zhuǎn)運體之間的相互作用.pdf

1、目的：
　　研究四物湯水煎液對Caco-2細(xì)胞P-糖蛋白功能和表達(dá)的影響，并通過考察四物湯及其配伍在基因水平對外排轉(zhuǎn)運體P-糖蛋白、MRP2和BCRP的影響，探討了四物湯的配伍規(guī)律；建立Caco-2單層細(xì)胞模型，考察了四物湯效應(yīng)成分梓醇、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪在體外的吸收特性。
　　方法：
　　1.Caco-2細(xì)胞采用MEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長80％時，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，建立正確的Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)

2、方法。用MTS法考察四物湯及其配伍藥對水煎液和四物湯效應(yīng)成分（梓醇、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪）對Caco-2細(xì)胞的毒性，選擇細(xì)胞相對存活率大于90%的受試藥液濃度作為最大安全濃度，進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實驗。
　　2.用流式細(xì)胞儀技術(shù)測定Caco-2細(xì)胞內(nèi)的熒光強度，考察四物湯水煎液對P-糖蛋白介導(dǎo)底物Rhodamin-123的外排作用，從而判斷四物湯水煎液對P-糖蛋白功能的影響。
　　3.四物湯水煎液與細(xì)胞作用24、48、72 h小時

3、后采用Q-PCR技術(shù)分析四物湯水煎液對Caco-2細(xì)胞上MDR1基因mRNA表達(dá)水平的影響；用Western blot技術(shù)分析四物湯水煎液與細(xì)胞作用48h后對Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白表達(dá)影響。
　　4.四物湯及其配伍藥對水煎液與細(xì)胞作用48 h小時后采用Q-PCR技術(shù)分析四物湯及其配伍藥對水煎液對Caco-2細(xì)胞上MDR1、MRP2和BCRP基因mRNA表達(dá)水平的影響。
　　5.首先建立UPLC-TOF-MS測定四物湯效

4、應(yīng)成分梓醇、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪的方法。再建立Caco-2單層細(xì)胞模型，研究四物湯效應(yīng)成分梓醇、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪的雙向跨膜轉(zhuǎn)運，用UPLC-TOF-MS測定樣品的濃度，并計算表觀滲透系數(shù)（Papp）和外排比（Er）。
　　結(jié)果：
　　1.在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下，Caco-2生長旺盛，且細(xì)胞呈不規(guī)則鵝卵石形貼壁生長。MTS結(jié)果顯示四物湯及其配伍藥對Caco-2細(xì)胞的最大安全濃度為相當(dāng)于含生藥濃度10 mg/ml，四物湯效

5、應(yīng)成分梓醇、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪在12.5-400 mol/L濃度內(nèi)對Caco-2細(xì)胞基本上沒有毒性影響。因此確定四物湯及其配伍藥對系列濃度為3.3-10 mg/ml，四物湯效應(yīng)成分系列濃度為100-400 mol/L。
　　2.四物湯水煎液3.3、5.0、10.0 mg/ml作用于Caco-2細(xì)胞1 h后，對胞內(nèi)Rhodamin-123的熒光強度沒有影響；三個不同濃度的四物湯水煎液作用于Caco-2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞內(nèi)Rho

6、damin-123的熒光強度分別減弱了16.6%、22.1%（P<0.05）、45.4%(P<0.01)，具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明四物湯水煎液對Caco-2細(xì)胞P-gp具有誘導(dǎo)作用。
　　3.在mRNA水平上：四物湯水煎液與Caco-2細(xì)胞作用24、48、72 h后對P-gp mRNA具有不同程度的上調(diào)作用，表明四物湯水煎液在mRNA水平對P-gp具有誘導(dǎo)作用，其中在給藥48 h實驗結(jié)果較為穩(wěn)定，且不同濃度的四物湯水煎液都有統(tǒng)計學(xué)意義

7、。在蛋白水平上：四物湯水煎液與Caco-2細(xì)胞作用48 h后，四物湯水煎液組熒光強度明顯高于空白對照組（P＜0.05），即四物湯水煎液能顯著降低Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白的表達(dá)。
　　4.熟地水煎液組對轉(zhuǎn)運體MDR1、MRP2和BCRP具有誘導(dǎo)作用；當(dāng)歸水煎液對MRP2具有抑制作用，對MDR1和BCRP具有誘導(dǎo)作用；白芍水煎液對MDR1沒有明顯的作用，對MRP2和BCRP具有誘導(dǎo)作用；川芎水煎液對轉(zhuǎn)運體MDR1、MRP2和BCR

8、P具有一定的誘導(dǎo)作用；各單藥與熟地兩兩配伍后，與四物湯水煎液對比，熟地+當(dāng)歸（君臣藥對）對MDR1具有較強的上調(diào)作用，對MRP2具有下調(diào)作用，熟地+白芍（君佐藥對）對MDR1具有下調(diào)的作用，對MRP2具有上調(diào)作用，四物湯水煎液對MRP2的上調(diào)作用最弱；三三配伍也出現(xiàn)類似的結(jié)果，與四物湯水煎液比較，熟地+當(dāng)歸+川芎（君臣使藥對）對MDR1具有上調(diào)作用，熟地+白芍+川芎（君佐使藥對）對MRP2具有上調(diào)作用，而熟地+當(dāng)歸+白芍（君臣佐藥對）對

9、MDR1具有下調(diào)作用，四物湯水煎液對MRP2的誘導(dǎo)作用最弱。
　　5.四物湯4種有效成分梓醇、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪雙向轉(zhuǎn)運的Papp值分別為10-5、10-5、10-7、10-6數(shù)量級，表觀滲透率（PDR）分別為2.76-0.84、1.04-1.27、1.31-1.87、1.06-1.09。
　　結(jié)論：
　　1.四物湯水煎液能上調(diào)Caco-2細(xì)胞膜上P-gp基因和蛋白表達(dá)的水平，增強了Caco-2細(xì)胞P-gp的外排功

10、能；四物湯水煎液干預(yù)1 h對P-gp的功能影響不是很明顯，其長期干預(yù)則能上調(diào)Caco-2細(xì)胞膜上P-gp的表達(dá)水平，提示四物湯水煎液對P-gp功能沒有瞬時效應(yīng)的影響。
　　2.四物湯水煎液對外排轉(zhuǎn)運體具有誘導(dǎo)作用，拆方后，當(dāng)歸加強了四物湯對MDR1的誘導(dǎo)作用，下調(diào)了四物湯對MRP2的誘導(dǎo)作用；白芍加強了四物湯對MRP2的誘導(dǎo)作用，而下調(diào)了四物湯對MDR1的作用。在中醫(yī)藥理論中，熟地、當(dāng)歸、白芍和川芎分別作為君、臣、佐和使藥，我們的