轉(zhuǎn)錄因子Tlx3在瘙癢和疼痛感受神經(jīng)元發(fā)育中的功能研究.pdf

1、瘙癢和疼痛是機(jī)體十分重要的兩種感覺，在物種的進(jìn)化過程中比較保守。在生理?xiàng)l件下，短暫的瘙癢和疼痛是一種保護(hù)機(jī)制，它能提示機(jī)體外界的有害刺激，從而做出相應(yīng)的反應(yīng)來避免進(jìn)一步的傷害，比如疼痛主要是引起一種退縮反應(yīng)，而瘙癢則引起強(qiáng)烈的抓撓欲望。雖然二者在個(gè)人體驗(yàn)以及反應(yīng)形式上差異巨大，但是其并不是完全獨(dú)立的，二者之間存在緊密的聯(lián)系。一些和疼痛相關(guān)的離子通道和受體也介導(dǎo)瘙癢信息的傳遞。隨著瘙癢研究的逐步深入，瘙癢相關(guān)受體和通路逐漸被發(fā)現(xiàn)，這些受體

2、參與的瘙癢信息的傳遞也需要部分疼痛相關(guān)離子通道的參與，比如TRPA1和TRPV1。疼痛和瘙癢之間還存在抑制關(guān)系，越來越多的證據(jù)表明疼痛確實(shí)能夠抑制瘙癢，而且一些相關(guān)的抑制通路也陸續(xù)被報(bào)道。相比于對(duì)疼痛的研究，瘙癢的研究本世紀(jì)以來才有了比較大的進(jìn)展，雖然部分瘙癢相關(guān)的受體、離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)以及神經(jīng)元陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，但是關(guān)于這些分子的表達(dá)以及相關(guān)神經(jīng)元發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，目前來說還很不清楚。一些文獻(xiàn)報(bào)道，部分轉(zhuǎn)錄因子參與感覺神經(jīng)元的發(fā)育調(diào)控，我們

3、實(shí)驗(yàn)室前期工作表明轉(zhuǎn)錄因子 Tlx3能夠調(diào)控背根神經(jīng)節(jié)中TrkA+神經(jīng)元向Ret+神經(jīng)元的分化，同時(shí)也能夠控制一系列疼痛相關(guān)分子的表達(dá)。由于瘙癢感受神經(jīng)元也是來源于TrkA+神經(jīng)元，所以我們猜測(cè)Tlx3也能夠調(diào)控瘙癢感受神經(jīng)元的分化發(fā)育以及瘙癢相關(guān)分子的表達(dá)。為了探究這一問題，我們構(gòu)建了Tlx3條件性敲除小鼠Tlx3F/F;Nav1.8-cre，即選擇性地在背根神經(jīng)節(jié)Nav1.8+神經(jīng)元中敲除Tlx3。
　　為了探究轉(zhuǎn)錄因子Tlx

4、3是否會(huì)調(diào)控瘙癢相關(guān)分子的表達(dá)水平，我們首先用RNAseq的方法比較了Tlx3條件性敲除小鼠和對(duì)照組小鼠背根神經(jīng)節(jié)的轉(zhuǎn)錄組差異，發(fā)現(xiàn)在Tlx3條件性敲除小鼠的背根神經(jīng)節(jié)中大部分目前已經(jīng)報(bào)道的瘙癢相關(guān)分子的表達(dá)明顯下降。為了進(jìn)一步驗(yàn)證RNAseq的結(jié)果，我們采用了mRNA原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了部分瘙癢相關(guān)分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在Tlx3條件性敲除小鼠的背根神經(jīng)節(jié)中MrgprA3，IL31ra，Nppb，Sst的表達(dá)完全缺失。以上結(jié)果證明了Tlx3是

5、許多瘙癢相關(guān)分子的表達(dá)所必須的。
　　為了探究 Tlx3條件性敲除小鼠背根神經(jīng)節(jié)中瘙癢相關(guān)分子的表達(dá)下調(diào)是否會(huì)影響小鼠的瘙癢行為，我們首先比較了Tlx3條件性敲除小鼠和對(duì)照組小鼠對(duì)多種致癢劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的急性瘙癢的反應(yīng)。我們選用了四種不同類型的致癢劑：Compound48/80，chloroquine，α-Me-5-HT，SLIGRL-NH2。Compound48/80能夠引起組胺依賴性瘙癢，而后三種引起非組胺依賴性瘙癢。Tlx3條件

6、性敲除小鼠對(duì)這四種致癢劑引起的急性瘙癢的反應(yīng)和對(duì)照組小鼠相比都明顯減弱，說明Tlx3能夠調(diào)控急性瘙癢的產(chǎn)生，既包括組胺依賴性瘙癢也包括非組胺依賴性瘙癢。
　　由于許多瘙癢相關(guān)受體也介導(dǎo)慢性瘙癢，所以我們又檢測(cè)了 Tlx3條件性敲除小鼠對(duì)慢性瘙癢的反應(yīng)。我們采用了兩種慢性瘙癢模型：皮膚干燥（Dry skin）和過敏性接觸性皮炎（Allergic contact dermatitis，ACD）模型。Tlx3條件性敲除小鼠對(duì)于Dry s

7、kin引起的慢性瘙癢的反應(yīng)比對(duì)照組小鼠弱，但是對(duì)于ACD引起的慢性瘙癢的反應(yīng)卻和對(duì)照組小鼠沒有明顯區(qū)別。說明Tlx3也參與調(diào)控部分類型慢性瘙癢的產(chǎn)生。由于許多瘙癢相關(guān)分子的表達(dá)都明顯缺陷，但是Tlx3條件性敲除小鼠仍然出現(xiàn)了明顯的瘙癢，提示慢性瘙癢的復(fù)雜性以及其他信號(hào)通路的參與。之前的報(bào)道表明在部分慢性瘙癢模型中TRPV1的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，這提示其可能參與慢性瘙癢。我們發(fā)現(xiàn)在Tlx3條件性敲除小鼠和對(duì)照組小鼠中TRPV1拮抗劑AMG981

8、0能明顯緩解Dry skin以及ACD引起的慢性瘙癢，表明TRPV1確實(shí)參與慢性瘙癢。
　　疼痛能夠抑制瘙癢，而有報(bào)道表明背根神經(jīng)節(jié)中的TRPV1+/TRPA1+神經(jīng)元參與這種抑制，為了探究其是否也受Tlx3調(diào)控，我們使用了辣椒素（capsaicin）和AITC(allyl isothiocyanate)面部注射實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)面部注射AITC在Tlx3條件性敲除小鼠和對(duì)照組小鼠都只引起了明顯的疼痛反應(yīng)，而幾乎沒有瘙癢反應(yīng)，說明抑制

9、通路沒有受到明顯影響。但是面部注射辣椒素在Tlx3條件性敲除小鼠卻引起了明顯增強(qiáng)的疼痛反應(yīng)，更意外的是同時(shí)也出現(xiàn)了明顯增強(qiáng)的瘙癢?？紤]到抑制通路是正常的，我們認(rèn)為這種明顯增強(qiáng)的瘙癢是由于辣椒素誘導(dǎo)的瘙癢本身增強(qiáng)，并且不能完全被抑制通路抑制才表現(xiàn)出來的。
　　由于辣椒素在Tlx3條件性敲除小鼠內(nèi)引起了明顯增強(qiáng)的疼痛和瘙癢，所以我們檢測(cè)了辣椒素的受體TRPV1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量在Tlx3條件性敲除小鼠的背根神經(jīng)節(jié)，脊髓以及皮膚中

10、都明顯增加。為了詳細(xì)地了解Tlx3條件性敲除小鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1的表達(dá)模式，我們進(jìn)行一系列的免疫熒光實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)在野生型小鼠的背根神經(jīng)節(jié)中只有約27％Tlx3+神經(jīng)元表達(dá)TRPV1而且絕大多數(shù)TRPV1+神經(jīng)元都不表達(dá)或者低表達(dá)Tlx3，進(jìn)一步證實(shí)Tlx3能夠抑制TRPV1的表達(dá)。Tlx3條件性敲除小鼠的背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1大幅度地?cái)U(kuò)展到IB4+非肽類神經(jīng)元中，同時(shí)其在CGRP+肽類神經(jīng)元的比例也有增加。相似地，在Tlx3條件

11、性敲除小鼠的脊髓背角，TRPV1+神經(jīng)纖維的投射區(qū)域也擴(kuò)展到IB4+神經(jīng)纖維投射區(qū)域即二層內(nèi)側(cè)（lamina IIi）。
　　考慮到Tlx3能夠調(diào)控許多疼痛相關(guān)受體，而且TRPV1也是感受熱刺激的主要受體之一，所以我們進(jìn)行了一系列疼痛行為學(xué)實(shí)驗(yàn)來探究Tlx3是否調(diào)控疼痛的產(chǎn)生。我們發(fā)現(xiàn)Tlx3條件性敲除小鼠對(duì)冷刺激以及炎癥性疼痛的反應(yīng)性明顯下降，而對(duì)于機(jī)械，熱刺激以及神經(jīng)病理性疼痛的反應(yīng)卻保持正常。由于TRPV1是目前已知的感受熱

12、的主要受體，雖然其表達(dá)水平在Tlx3條件性敲除小鼠中明顯升高，但是 Tlx3條件性敲除小鼠對(duì)熱刺激的反應(yīng)卻沒有明顯變化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一現(xiàn)象，我們采用了脊髓神經(jīng)元激活實(shí)驗(yàn)來判斷熱刺激是否能夠在Tlx3條件性敲除小鼠的脊髓背角激活更多的神經(jīng)元，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱刺激在Tlx3條件性敲除小鼠和對(duì)照組小鼠脊髓內(nèi)激活的脊髓神經(jīng)元數(shù)量沒有明顯差別，而辣椒素在Tlx3條件性敲除小鼠脊髓內(nèi)激活的神經(jīng)元數(shù)量卻明顯比對(duì)照組小鼠多，說明Tlx3條件性敲除小鼠內(nèi)明

13、顯增加的TRPV1使得其對(duì)辣椒素的敏感性增加，卻不影響其對(duì)熱刺激的反應(yīng)。
　　綜上，本研究證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子 Tlx3能夠調(diào)控大部分瘙癢相關(guān)分子的表達(dá)，其功能缺失導(dǎo)致瘙癢相關(guān)分子的表達(dá)下降或者消失，從而使小鼠對(duì)急性瘙癢和部分慢性瘙癢的反應(yīng)明顯減弱。Tlx3能夠抑制TRPV1的表達(dá)，Tlx3條件性敲除小鼠內(nèi)TRPV1的表達(dá)明顯增加，這就導(dǎo)致面部注射辣椒素在Tlx3條件性敲除小鼠內(nèi)引起了同時(shí)增強(qiáng)的疼痛和瘙癢。Tlx3也參與調(diào)控冷痛和炎癥性