移動通訊射頻輻射對神經(jīng)元基因表達(dá)譜及轉(zhuǎn)錄因子影響的研究.pdf

1、隨著通訊事業(yè)的發(fā)展和移動通訊設(shè)備的普及，人群暴露于移動電話產(chǎn)生的射頻電磁場(radiofrequencyelectromagneticfields，RFEMF)(頻率主要為800-2000MHz)的時間和強(qiáng)度也不斷增加，隨之引起的健康問題備受矚目。已有研究顯示，RFEMF可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervesystem，CNS)、免疫系統(tǒng)和血液系統(tǒng)等許多系統(tǒng)產(chǎn)生影響。其中，由于CNS對外界刺激的反應(yīng)是最敏感的，加之移動電話使用時

2、緊貼頭部，因此，腦被認(rèn)為是射頻輻射作用的主要靶器官。相應(yīng)地，很多研究將CNS對RFEMF作用的反應(yīng)和各種功能變化作為機(jī)體功能調(diào)節(jié)受影響的早期指標(biāo)。盡管有流行病學(xué)調(diào)查及動物實(shí)驗(yàn)報道，移動電話可以引起頭痛、失眠、記憶力衰退等神經(jīng)功能紊亂癥狀，導(dǎo)致血腦屏障通透性和腦電圖改變，引起神經(jīng)細(xì)胞損傷，甚至與腦部腫瘤的發(fā)生相關(guān)，但同時也存在一些陰性報道。鑒于目前射頻研究領(lǐng)域中使用的輻照模式、細(xì)胞類型和檢測指標(biāo)多樣，目前的研究結(jié)果缺乏可比性。另一方面RF

3、EMF產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的作用機(jī)制不明，導(dǎo)致無法確定專一的、與損害發(fā)生相關(guān)的暴露參數(shù)。所以，迄今為止尚未得出移動電話射頻輻射對人體健康影響的明確結(jié)論。作為一種可能的刺激因素，移動電話射頻輻射即使沒有引起宏觀上明顯的健康效應(yīng)，細(xì)胞和分子水平的變化也可能已經(jīng)發(fā)生。因此，從細(xì)胞和分子水平探討RFEMF的生物學(xué)效應(yīng)和作用機(jī)制、確定流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究的生物指標(biāo)成為揭示射頻輻射影響人體健康的有效手段。 基因轉(zhuǎn)錄是細(xì)胞受外界因素作用后通過系列信使

4、傳遞的終端，因此發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄的特異改變是最終揭示RFEMF與生物系統(tǒng)相互作用機(jī)制的關(guān)鍵之一。在射頻輻射影響基因表達(dá)的研究方面，熱休克蛋白、原癌基因、即刻早期基因以及一些特異性基因都有報道，但這些基因一般是根據(jù)研究者的假設(shè)事先確定的少數(shù)幾個基因，故而無法全面反映射頻輻射對整個基因組轉(zhuǎn)錄水平的影響。作為發(fā)現(xiàn)性科學(xué)的代表，上世紀(jì)90年代問世的基因芯片技術(shù)，為我們研究移動通訊RFEMF的生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制提供了有利手段，它可以克服以往對單個或某

5、些基因研究的局限性，同時對大量不同功能的基因進(jìn)行篩選，尋找RFEMF反應(yīng)基因。芯片技術(shù)在具有大規(guī)模、高通量等優(yōu)點(diǎn)的同時，尚存在一定的假陽性。為了排除芯片的假陽性，往往要通過熒光實(shí)時定量PCR(real-timequantitivepolymerasechainreaction，real-timePCR)、核糖核酸酶保護(hù)分析(RNaseprotectionassay,RPA)、反轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)、Nortern印跡雜交(Norte

6、rnblotting)等方法進(jìn)行驗(yàn)證。 研究認(rèn)為電磁場(electromagneticfields，EMF)可以影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，而細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的最終效應(yīng)是影響轉(zhuǎn)錄因子的活性，轉(zhuǎn)錄因子活性改變又會進(jìn)一步影響其下游基因的表達(dá)。有報道認(rèn)為電磁場作為一種環(huán)境物理因素，可以影響AP-1、AP-2、CREB以及HSF等在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性。轉(zhuǎn)錄因子(activatorprotien-1，AP-1)是由fos(55kDa)

7、和jun(39kDa)組成的二聚體，通過亮氨酸拉鏈與DNA結(jié)合。AP-1的激活是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的經(jīng)典途徑之一。胞外刺激通過激活受體酪氨酸激酶、小G蛋白，進(jìn)而激活MAPK的級鏈反應(yīng)，磷酸化c-jun和c-fos，形成活化形式的AP-1轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位入核。包括MAPK和PKC等在內(nèi)的多種蛋白激酶可以激活A(yù)P-1，使其以不同二聚體的形式激活不同靶基因的轉(zhuǎn)錄。對AP-1的生物學(xué)功能的研究表明，它在細(xì)胞的增殖、分化、適應(yīng)性和凋亡等許多生理過程中

8、發(fā)揮重要作用。許多研究小組通過不同的模型還發(fā)現(xiàn)，激活的AP-1通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和腫瘤的啟動以及演進(jìn)過程。此外，還有報道認(rèn)為AP-1參與學(xué)習(xí)、記憶過程。凝膠阻滯遷移分析實(shí)驗(yàn)(electrophoresismobilityshiftassay,EMSA)是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，根據(jù)結(jié)合片段和DNA片斷的分子量差異通過電泳進(jìn)行分離。本研究是利用EMSA方法檢測經(jīng)217Hz調(diào)制的GSM18

9、00MHzRFEMF對AP-1的DNA結(jié)合活性的影響，并探討參與此RFEMF反應(yīng)的信號通路。 鑒于公眾普遍擔(dān)心的是移動電話使用能否引起學(xué)習(xí)能力下降、記憶力衰退等中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂以及腫瘤的發(fā)生，我們選擇體外原代培養(yǎng)的大鼠皮層和海馬神經(jīng)元，研究移動電話RFEMF對神經(jīng)元的基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。 第一部分：移動通訊射頻輻射對大鼠神經(jīng)元基因表達(dá)譜的影響 以體外原代培養(yǎng)的大鼠皮層和海馬神經(jīng)元為研究對象，觀察21

10、7Hz調(diào)制的GSM1800MHzRFEMF對大鼠神經(jīng)元基因表達(dá)譜的影響。將大鼠大腦皮層和海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)至第13天，隨機(jī)分為兩組：實(shí)驗(yàn)組(輻照組)和對照組(假輻照組)，移入瑞士聯(lián)邦工業(yè)大學(xué)(ETH)最新研制的1800MHz細(xì)胞輻照系統(tǒng)進(jìn)行輻照或假輻照。整個輻照過程中，細(xì)胞處于37℃±0.1℃、5％CO2的孵箱中。實(shí)驗(yàn)選用的輻照強(qiáng)度比吸收率(specificabsorptionrate，SAR)為2W/kg，模式為24h間斷輻照(5mi

11、nfieldson/10minfieldsoff)。本課題組曾使用Affymetrix公司的大鼠神經(jīng)生物基因芯片U34在1300多個候選基因中檢測到大約600個表達(dá)基因，其中34個為差異表達(dá)基因(包括24個上調(diào)基因和10個下調(diào)基因)。為排除芯片結(jié)果的假陽性，本研究先后采用了RPA和real-timePCR對基因芯片篩選到的部分差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。通過對多窩和單窩SD乳鼠神經(jīng)元輻照后提取的RNA的基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，確定Map2和Pl

12、p為RFEMF反應(yīng)基因，發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)的改變不僅與RFEMF輻照有關(guān)，還存在個體差異。我們的研究結(jié)果顯示，強(qiáng)度為2W/kg的217Hz調(diào)制的GSM1800MHzRFEMF間斷輻照24h可以引起大鼠神經(jīng)元基因表達(dá)的改變，但不同個體對基因的反應(yīng)性存在差異。結(jié)合RFEMF在細(xì)胞和分子水平上的同類研究，神經(jīng)元顯示出對射頻輻射較好的反應(yīng)性，可能是RFEMF反應(yīng)的敏感細(xì)胞，可以作為該類研究的細(xì)胞模型。 第二部分：移動通訊射頻輻射對神經(jīng)元AP-

13、1結(jié)合活性的影響 為了研究RFEMF對轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)信號通路的影響，使用EMSA方法檢測大鼠皮層和海馬神經(jīng)元經(jīng)217Hz調(diào)制的GSM1800MHz射頻輻照后，AP-1的DNA結(jié)合活性的變化。細(xì)胞培養(yǎng)和輻照系統(tǒng)與第一部分相同，輻照強(qiáng)度SAR為2W/kg，模式為24h間斷輻照(5minfieldson/10minfieldsoff)，選擇15min，30min，1h，2h和4h五個不同時間點(diǎn)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，1800MHzRFE

14、MF輻照前后AP-1的DNA結(jié)合活性發(fā)生變化，而且這種變化呈現(xiàn)時間依賴性，于輻照30min后開始升高，1h達(dá)高峰，2h開始下降，4h恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。為了探討各信號通路在RFRMF誘導(dǎo)的AP-1激活中的作用，使用包括ERK抑制劑PD98059、JNK抑制劑Ⅱ(SP600125)、p38MAPK抑制劑SB203580、PKA和PKC抑制劑Staurosporine以及胞外Ca2+螯合劑EGTA、胞內(nèi)Ca2+螯合劑BAPTA/AM在內(nèi)的多種信

15、號通路抑制劑處理細(xì)胞后再進(jìn)行輻照。發(fā)現(xiàn)移動電話射頻輻射誘導(dǎo)的AP-1結(jié)合活性的升高依賴于MAPK家族中的JNK/SAPK和p38MAPK激酶，而ERK、PKA、PKC以及細(xì)胞內(nèi)外Ca2+不參與此效應(yīng)。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本實(shí)驗(yàn)條件下1800MHzRFEMF誘導(dǎo)的AP-1激活具有時間依賴性，而且受JNK/SAPK和p38MAPK激酶信號通路調(diào)控。 本學(xué)位論文的主要創(chuàng)新： 1.本研究利用RPA及real-timePCR方法在大

16、鼠神經(jīng)元中確定Map2和Plp為RFEMF反應(yīng)基因，并發(fā)現(xiàn)不同個體對基因的反應(yīng)性存在差異。 2.我們還發(fā)現(xiàn)1800MHzRFEMF誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子AP-1的激活依賴于JNK/SAPK和p38MAPK激酶信號通路，且具有時間依賴性：于輻照30min后開始升高，1h達(dá)高峰，2h開始下降，4h恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。從而確定AP-1為RFEMF的反應(yīng)因子。 3.本研究首次將原代培養(yǎng)的大鼠皮層和海馬神經(jīng)元用于1800MHzRFEMF對功能