重組傳染性支氣管炎病毒的生物學(xué)特性及CD59分子對其增殖的影響.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是由傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一種高度接觸性傳染病，給家禽飼養(yǎng)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，IBV全球廣泛分布并且存在很多種血清型。IBV新血清型的不斷出現(xiàn)迫切需要一種安全高效的疫苗用毒株制備方法以應(yīng)對這些變異株。利用反向遺傳操作來改造IBV基因組可以滿足這一要求，構(gòu)建的重組病毒有望成為新的疫苗用毒株。本研究首先構(gòu)

2、建了可在vero細(xì)胞生長的IBV Beaudette(p65)毒株的感染性克隆，簡略方法如下:利用RT-PCR的方法從感染病毒的細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出IBV基因組拆分的5個(gè)片段，然后分別插入到pGEM-T Easy或者pCR-XL-TOPO載體中，在此過程中BsaⅠ或BsmBⅠ酶切位點(diǎn)通過引物帶入各個(gè)片段的兩端，19個(gè)核苷酸的T7啟動(dòng)子加到A片段的5'端用于依靠T7聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。5個(gè)重組質(zhì)粒用BsaⅠ或BsmBⅠ酶切割后得到相應(yīng)的5

3、片段，然后將純化的5片段連接成IBV基因組全長cDNA，全長cDNA和含IBV N基因的線性質(zhì)粒被分別體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后的兩產(chǎn)物混合后電轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，具有感染性的病毒被拯救成功。
　　為探索以IBV Beaudette毒株為骨架表達(dá)H120S基因膜外區(qū)的可行性，本研究將H120S基因膜外區(qū)段(1，302bp)置換到Beaudette株全長cDNA相應(yīng)區(qū)段，構(gòu)建了重組全長cDNA，然后以其為模板體外轉(zhuǎn)錄出全長轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和N

4、基因轉(zhuǎn)錄本一起電轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，48小時(shí)收獲細(xì)胞繼續(xù)傳代，直至第4代時(shí)出現(xiàn)合胞體，拯救獲得重組1BV，并命名為rBeau-H120(S1)。RT-PCR證明rBeau-H120(S1)基因組中包含有完整的H120S基因膜外區(qū)段。Western-blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)rBeau-H120(S1)的N蛋白有表達(dá)，表明重組病毒拯救成功。rBeau-H120(S1)連續(xù)傳代后測定TCID50和EID50，結(jié)果顯示，該重組病毒在Vero細(xì)胞中的滴度可

5、達(dá)到105.90±0.22TCID50/mL，在9日齡SPF雞胚中生長滴度峰值為106.13±0.23EID50/mL。免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明，在接種重組病毒21天時(shí)，雞群抗體陽性率達(dá)到90‰使用M41強(qiáng)毒株(103EID50/只)攻毒時(shí)免疫保護(hù)率為85％。
　　同時(shí)，我們將4/91毒株S基因膜外區(qū)段置換到Beaudette株全長cDNA相應(yīng)區(qū)段，構(gòu)建了重組病毒BeauR-4/91(S1)。BeauR-4/91(S1)在vero細(xì)胞內(nèi)的

6、滴度與親本毒Beaudette株基本一致，峰值為105.75TCID50/mL，接種雞只后無致病力，在體內(nèi)僅可有限復(fù)制。免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明，BeauR-4/91(S1)接種7日齡雛雞后21天用野生型4/91毒株(103EID50/只)攻毒時(shí)免疫保護(hù)率為80％。本研究構(gòu)建的重組IBV有望成為現(xiàn)有疫苗的替代株，同時(shí)為將來田間毒株S基因膜外區(qū)段置換到Beaudette株全長cDNA相應(yīng)區(qū)段提供參考。
　　CD59蛋白可在補(bǔ)體活化的最后階段

7、阻止攻膜復(fù)合物的形成，有研究表明，HIV病毒顆粒可攜帶CD59分子而提高其在體液循環(huán)中的病毒滴度，為了提升重組IBV在體內(nèi)的滴度而增強(qiáng)免疫效果，我們研究了補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD59對IBV生命過程的影響，研究結(jié)果顯示，IBV粒子可攜帶CD59，廢除CD59功能后可增加IBV顆粒對抗體依賴的補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解作用的敏感性，顯著降低IBV的感染性。此外，IBV感染細(xì)胞后可使細(xì)胞膜上CD59的表達(dá)量減少，過表達(dá)CD59可增強(qiáng)細(xì)胞上清液中病毒的滴度，而敲