歐芹不同逆境條件下適宜內(nèi)參基因的篩選.pdf

1、歐芹(Petroselinum crispum L.)，又名洋芫荽和法國香菜等，屬于傘形科歐芹屬一二年生草本植物。作為香辛蔬菜，食用嫩葉，鮮根、莖汁可供藥用。非生物脅迫，包括溫度（高溫、低溫）、鹽害和干旱等，是導(dǎo)致歐芹減產(chǎn)的重要因素之一。分離歐芹相關(guān)的抗性基因，篩選與抗性性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)于歐芹抗逆品種的選育有重要的意義。qRT-PCR是定量基因轉(zhuǎn)錄水平的主要方法之一，需要使用內(nèi)參基因(Reference gene)校正目標(biāo)基因

2、的表達(dá)量。
　　本實(shí)驗(yàn)克隆了歐芹相關(guān)內(nèi)參基因的部分片段，使用qRT-PCR技術(shù)建立每個(gè)基因相對(duì)應(yīng)實(shí)時(shí)熒光定量的方法，研究了不同逆境條件下內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性。同時(shí)，為進(jìn)一步驗(yàn)證在本研究中確定的內(nèi)參基因，還對(duì)pcDREB1基因在歐芹高溫脅迫下的表達(dá)譜進(jìn)行了研究。具體研究結(jié)果如下:
　　(1)以歐芹葉片cDNA為模板，篩選了8條內(nèi)參基因(GAPDH、ACTIN、eIF-4α、SAND、UBC、TIP41、EF-1α和TUB)的中

3、間片段。與其他物種的同源基因進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示堿基相似度均在80％以上。
　　(2)利用qRT-PCR技術(shù)建立了上述8條基因相對(duì)應(yīng)的實(shí)時(shí)定量方法。結(jié)果表明當(dāng)10倍稀釋cDNA為擴(kuò)增模板時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的敏感性和相關(guān)性較高，并且能在高通量范圍內(nèi)顯示cDNA樣品的起始量，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了較為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。
　　(3)采用不同脅迫和激素處理的定量cDNA為模板，利用qRT-PCR技術(shù)，對(duì)篩選得到的8條內(nèi)參基因通過geNor

4、m、BestKeeper及NormFinder三個(gè)生物學(xué)軟件計(jì)算進(jìn)行穩(wěn)定性分析。不同處理下，歐芹不同內(nèi)參基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明，TUB和ACTIN在高溫處理中顯示相對(duì)最為穩(wěn)定的表達(dá)水平;低溫脅迫下eIF-4α和GAPDH均可應(yīng)用于穩(wěn)定性分析;干旱處理，EF-1α和ACTIN為最佳內(nèi)參基因;干旱脅迫處理的最佳選擇是EF-1α和GAPDH;GA和ABA處理下均為EF-1α的表達(dá)穩(wěn)定性最佳，MeJA和SA處理?xiàng)l件下ACTIN和E