金柑多糖結(jié)構(gòu)表征及降血脂機理的研究.pdf

1、金柑(Fortunella margarita(Lour.) Swingle)，也稱金桔、綠桔、金彈桔、金棗，原產(chǎn)于我國華南地區(qū)，在歐洲、日本、美國、巴西、澳大利亞、南非和印度等地區(qū)有著廣泛種植。金柑營養(yǎng)價值很高，含有人體所需多種維生素、氨基酸以及豐富的多糖、精油、檸檬苦素、黃酮等活性物質(zhì)。本文系統(tǒng)地研究了不同制備方法對金柑多糖結(jié)構(gòu)特性的影響，金柑多糖流變學特性、熱穩(wěn)定性及微觀構(gòu)象，金柑多糖分子結(jié)構(gòu)特性，金柑多糖各組分分離純化、結(jié)構(gòu)表征

2、，并結(jié)合各組分體外降血脂構(gòu)效關(guān)系，對高血脂癥大鼠降血脂機理進行了研究。研究成果為金柑的高值化加工和多糖的開發(fā)利用提供了重要的理論依據(jù)，填補國內(nèi)外研究空白，豐富了糖科學的研究內(nèi)涵。
　　（1）不同制備方法對金柑多糖結(jié)構(gòu)特性的影響
　　本章采用傅里葉紅外光譜（FT-IR）、核磁共振（1H NMR和13C NMR）和凝膠滲透色譜、多角度激光光散射與示差折光檢測儀（SEC-MALLS-RI）聯(lián)用技術(shù)等對熱水浸提金柑多糖（WFP）、超

3、聲波輔助提取金柑多糖（UFP）、微波輔助提取金柑多糖（MFP）和超聲波微波協(xié)同萃取金柑多糖（UMFP）的結(jié)構(gòu)特性進行表征。結(jié)果表明，金柑多糖最佳的超聲微波協(xié)同提取工藝條件為：超聲波功率為131W，微波功率為105W，液料比為62mL/g，提取時間為120s，在此條件下，多糖得率為9.15±0.13％，相比傳統(tǒng)熱水浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法，多糖得率分別提高了405.52%、128.18%和76.64%。FT-IR、1H N

4、MR和13C NMR分析表明，WFP、UFP、MFP和UMFP均為典型的糖類化合物，糖苷鍵類型以β-型糖苷鍵為主，并有少量的α-型糖苷鍵。SEC-MALLS-RI分析表明，WFP和UMFP分子量大部分分布在5.0×106~1.0×107g/mol范圍內(nèi)，分別占其總分子數(shù)量的57.80%和56.84%；UFP和MFP分子量大部分分布在1.0×106~5.0×106 g/mol范圍內(nèi)，分別占其總分子數(shù)量的38.24%和52.39%，這表明超

5、聲波輔助和微波輔助提取法對金柑多糖分子產(chǎn)生了一定的降解作用，而超聲波微波協(xié)同萃取法對金柑多糖結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生影響。
　?。?）金柑多糖流變學特性的研究
　　本章對金柑粗多糖（C-FMPS）和純多糖（P-FMPS）的靜態(tài)流變學和動態(tài)流變學進行對比研究。靜態(tài)流變學研究表明，鹽離子的添加使金柑多糖溶液粘度降低，C-FMPS具有很好的酸堿耐受能力，而P-FMPS具有很好的耐酸能力，耐堿能力弱；C-FMPS和P-FMPS溶液體系屬于觸變體

6、系，且P-FMPS溶液的剪切結(jié)構(gòu)恢復力要低于同濃度的C-FMPS。動態(tài)流變學研究表明，金柑多糖C-FMPS和P-FMPS結(jié)構(gòu)未被破壞的線性粘彈區(qū)分別在8.55%和2.78%應(yīng)變以內(nèi)；在應(yīng)力為2%時，P-FMPS和C-FMPS溶液的儲能模量G’始終高于損失模量G”，體系以粘性為主，說明溶液體系表現(xiàn)為非永久性形變；在溫度20-80℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多糖溶液的復合粘度逐漸降低，儲能模量始終高于損耗模量，說明溶液體系主要表現(xiàn)為彈性行為，

7、多糖結(jié)構(gòu)未收到破壞；C-FMPS和P-FMPS溶液為剪切變稀的假塑性流體，其流動特性符合Power Law模型，且表觀粘度和剪切應(yīng)力隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，濃度越高，溶液偏離牛頓流體越遠，相同濃度條件下，P-FMPS溶液的表觀粘度和剪切應(yīng)力均大于C-FMPS溶液。
　?。?）金柑多糖熱穩(wěn)定性及微觀構(gòu)象的研究
　　本章采用差式量熱掃描儀（DSC）和動態(tài)熱機械分析儀（DMA）研究C-FMPS和P-FMPS的熱穩(wěn)定性，采用SEC

8、-MALLS-RI測定其分子量，采用環(huán)境掃描電鏡（SEM）和激光共聚焦掃描顯微鏡（CSLM）觀察其微觀構(gòu)象。結(jié)果表明，P-FMPS氧化分解的溫度要高于C-FMPS，且在氧化分解過程中P-FMPS釋放出了較高的熱量；在掃描溫度為25-200℃范圍內(nèi)，P-FMPS的儲能模量和損耗模量均高于C-FMPS的儲能模量和損耗模量；P-FMPS儲能模量變化平緩，而C-FMPS儲能模量變化陡峭；P-FMPS損耗模量的峰型寬而平，而C-FMPS損耗模量的

9、峰型窄而高，在高溫條件下，P-FMPS較C-FMPS穩(wěn)定。P-FMPS的分子量分布和相對分子量均大于C-FMPS。SEM對多糖粉末的觀察表明，C-FMPS表面粗糙、緊密，無孔狀結(jié)構(gòu)，而P-FMPS表面較緊密、平整，大量立方孔或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。CSLM對多糖溶液的觀察表明，C-FMPS分子分散在溶液當中，無網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；而P-FMPS分子聚集，有明顯的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這是由于多糖在純化的過程中多糖分子發(fā)生了重新組合和聚集，導致P-FMPS的分子量增大。C

10、-FMPS和P-FMPS分子量和微觀結(jié)構(gòu)的差異導致其流變學特性和熱穩(wěn)定性的顯著差異。
　　（4）金柑多糖分子結(jié)構(gòu)特性的研究
　　本章采用 SEC-MALLS-RI聯(lián)用技術(shù)系統(tǒng)測定多糖的分子量、分子量分布、多分散系數(shù)、均方根旋轉(zhuǎn)半徑、半徑分布及其溶液鏈構(gòu)象。金柑多糖重均分子量（Mw）為6.192×106(±0.814%) g/mol，多分散系數(shù)（Mw/Mn）為17.376(±7.974%)，均方根旋轉(zhuǎn)半徑（Rw）為42.1(±

11、9.2%) nm，這表明金柑多糖是一種高度分散的大分子聚合物；分子量分布研究表明：金柑多糖分子量主要分布在1×105-5×106 g/mol范圍內(nèi)，占總分子質(zhì)量的86.48%；峰分布表明：金柑多糖四個峰（P1、P2、P3和P4）分子分別占總分子質(zhì)量的19.00%、31.60%、31.00%和18.40%，P2和P3組分（達62.6%）為金柑多糖的主要成分，其分子量分布范圍為1.507×105-1.984×106 g/mol，這表明金柑多

12、糖由四個不同分子量片段的多糖組成。分子均方根旋轉(zhuǎn)半徑分布表明：金柑多糖分子半徑主要分布在20-50nm范圍內(nèi)，占總分子質(zhì)量的88.79%，且分子質(zhì)量與分子均方根旋轉(zhuǎn)半徑未成正相關(guān)性；在溶液中，金柑多糖為緊密均勻的球形構(gòu)象。以上結(jié)果表明，金柑多糖是一種含有不同分子量片段的雜多糖，這將為進一步研究其分離純化、構(gòu)效關(guān)系以及功能活性作用機理提供理論依據(jù)。
　?。?）金柑多糖分級純化的研究
　　本章采用DEAE Sepharose C

13、L-6B瓊脂糖凝膠柱線性和梯度洗脫法分級純化金柑多糖，并采用Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析對各組分進一步分級純化，采用HPLC色譜法和紫外-可見光譜掃描對各多糖組分進行純度鑒定。結(jié)果表明，線性洗脫法未能將金柑多糖完全分離開來，而采用梯度洗脫法能較好的將金柑多糖各組分分離開來，得到4種不同分子量片段的多糖組分（FMPS1、FMPS2、FMPS3和FMPS4），這與金柑多糖分子結(jié)構(gòu)特性的研究結(jié)果一致。純度鑒定結(jié)果表明，F(xiàn)MPS

14、1、FMPS2、FMPS3和FMPS4均為分子量相對單一均勻的多糖組分；各多糖組分在260nm和280nm附近無蛋白質(zhì)和氨基酸的特征吸收峰，這表明四種組分均為純度較高的多糖。
　?。?）金柑多糖各組分結(jié)構(gòu)表征的研究
　　本章采用FT-IR、SEC-MALLS-RI體系、1D NMR和2D NMR等檢測技術(shù)對金柑多糖各組分FMPS1、FMPS2、FMPS3和FMPS4的分子結(jié)構(gòu)進行了表征。結(jié)果表明，F(xiàn)MPS1和FMPS3為果膠

15、類多糖，F(xiàn)MPS1和FMPS2的糖苷鍵類型以α-型糖苷鍵為主，并有少量的β-型糖苷鍵，F(xiàn)MPS3以β-型糖苷鍵為主，并有少量的α-型糖苷鍵，F(xiàn)MPS4以β-型糖苷鍵鏈接而成；各組分的Mw分別為2.572×107 (±0.517%)、1.755×106(±2.009%)、2.563×105(±1.784%)和2.411×105(±1.808%) g/mol，Mw/Mn分別為1.090(±0.708%)、1.220(±2.813%

16、)、1.124(±2.508%)和1.842(±2.509%)，Rw分別為44.6(±0.8%)、33.4(±6.7%)、15.3(±27.5%)和9.4(±69.6%) nm；在溶液中，F(xiàn)MPS1呈現(xiàn)緊密均勻的球形構(gòu)象，F(xiàn)MPS2呈現(xiàn)無規(guī)則線團構(gòu)象，F(xiàn)MPS3和FMPS4為典型的高支化度聚合物；FMPS1主要由α-Glc、α-GalA、β-Rha和β-Galp組成，其初步結(jié)構(gòu)單元為-α-Glc-β-Galp-β-Rha-α-GalA-

17、α-Glc-。FMPS4主要由α-Ara、α-Glc、β-Rha、β-Galp和β-Man組成，其初步結(jié)構(gòu)單元為-α-Ara-β-Rha-β-Galp-α-Glc-β-Man-α-Ara-。
　?。?）金柑多糖各組分體外降血脂作用及其構(gòu)效關(guān)系的研究
　　本章對金柑多糖各組分胰脂肪酶活性抑制、體外膽酸鹽結(jié)合能力和抗氧化活性進行了研究，并將各組分活性與結(jié)構(gòu)進行了對比研究。結(jié)果表明，金柑多糖FMPS1和FMPS3表現(xiàn)出了較強的胰脂

18、肪酶活性抑制作用，這與其單糖組成和相對分子量有關(guān)；金柑多糖 FMPS1和FMPS2表現(xiàn)出了較強的體外膽酸鹽結(jié)合能力，其結(jié)合能力受到相對分子量的影響；抗氧化活性表明，F(xiàn)MPS3表現(xiàn)出了較強的抗氧化活性，F(xiàn)MPS4次之，F(xiàn)MPS1和FMPS2的抗氧化活性較弱，金柑多糖的抗氧化活性受其結(jié)構(gòu)特征的影響，如：單糖組成、糖苷鍵類型、分子量、分子半徑和溶液鏈構(gòu)象等。金柑多糖各組分降血脂活性并不是由單一脂質(zhì)代謝途徑所決定，而是多途徑綜合影響的結(jié)果。此外

19、，金柑多糖降血脂活性也不是單一結(jié)構(gòu)因素導致的結(jié)果，而是多重結(jié)構(gòu)因素相互作用的結(jié)果。
　?。?）金柑多糖對高血脂癥大鼠降血脂機理的研究
　　本章以大鼠為研究對象，采用高脂飼料誘導大鼠形成動物脂代謝紊亂模型，以普通飼料為空白對照，以辛伐他丁為陽性對照，研究金柑多糖低劑量、中劑量和高劑量對高血脂癥大鼠血清血脂水平及血漿和組織中抗氧化指標的影響。結(jié)果表明，相對于高脂模型組，金柑多糖能顯著降低高血脂癥大鼠血清 TG、TC、LDL-C和

20、NEFA含量，顯著提高HDL-C和LIPA含量；金柑多糖可顯著提高高血脂癥大鼠血漿和組織中SOD、GSH-Px和GST活力及T-AOC能力，同時顯著降低MDA含量，且存在一定的量效關(guān)系；此外，金柑多糖可顯著降低高血脂癥大鼠體重、肝臟和脾臟指數(shù)，且表現(xiàn)出了一定的劑量依賴性。高血脂癥大鼠肝臟和血管病理學觀察結(jié)果表明，金柑多糖可減少高脂血癥大鼠肝細胞內(nèi)脂肪沉積， 對血管內(nèi)皮細胞起到了一定的保護作用。這表明金柑多糖對高血脂癥大鼠的血脂