核桃內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)油及其代謝基礎(chǔ)分析.pdf

1、以廉價(jià)木質(zhì)纖維素原料為基質(zhì)生產(chǎn)的微生物油脂用于第三代生物柴油的生產(chǎn)已引起了全世界的廣泛關(guān)注。從產(chǎn)油植物分離的內(nèi)生菌可能具有積累與宿主植物類似的油脂的潛能。然而，從產(chǎn)油植物分離的產(chǎn)油內(nèi)生細(xì)菌及其利用木質(zhì)纖維素水解液生產(chǎn)油脂的研究尚未見報(bào)道。
　　從含油量較高的新疆薄皮核桃果實(shí)內(nèi)生環(huán)境分離獲得了一株產(chǎn)油內(nèi)生細(xì)菌HB1310，經(jīng)16SrDNA序列分子生物學(xué)和生理生化特征分析，鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。該菌

2、株能夠有效利用棉稈水解糖液積累胞內(nèi)油脂。優(yōu)化的分批發(fā)酵條件分別確定為C/N比50/1、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵起始pH值6.5，該條件下菌株油脂含量可達(dá)菌體干重的30％以上。在此基礎(chǔ)上對(duì)其分批發(fā)酵產(chǎn)油過程進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析和擬合，構(gòu)建了擬合較好的動(dòng)力學(xué)模型。為深入研究菌株HB1310發(fā)酵產(chǎn)油的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，本研究還通過對(duì)不同發(fā)酵時(shí)期的菌株細(xì)胞進(jìn)行尼羅紅熒光染色和透射電鏡觀察，闡明了該菌株在不同發(fā)酵時(shí)間積累胞內(nèi)油脂的潛能。對(duì)菌株所產(chǎn)油脂脂肪酸組分

3、的分析表明其脂肪酸的主要成分是肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸，其估算的十六烷值為61.8，證明該菌株所產(chǎn)脂肪酸較適合用于生物柴油的生產(chǎn)。
　　對(duì)核桃內(nèi)生細(xì)菌HB1310分批發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)油的過程進(jìn)行了分段控溫、調(diào)控pH值和補(bǔ)料調(diào)控。結(jié)果表明，分段控溫方式對(duì)全發(fā)酵過程中菌體的生物量、葡萄糖和木糖利用率的提高均有顯著的促進(jìn)作用，使得菌株的油脂含量在發(fā)酵前期低于對(duì)照，在發(fā)酵后期有一定幅度提高，其增幅可達(dá)8％～13％。pH調(diào)控

4、處理對(duì)菌體胞內(nèi)油脂積累的改善作用較小，僅在pH7.0下培養(yǎng)24h的處理能在發(fā)酵后期（發(fā)酵48h后）對(duì)細(xì)菌油脂的積累起到一定改善作用。補(bǔ)料發(fā)酵是一種有效促進(jìn)核桃內(nèi)生細(xì)菌積累胞內(nèi)油脂的發(fā)酵方式，本研究中采用的三種補(bǔ)料方式均實(shí)現(xiàn)了核桃內(nèi)生細(xì)菌生物量的小幅增加和菌株油脂含量的大幅度提高，其油脂含量增長(zhǎng)幅度達(dá)18％～24％。
　　對(duì)核桃內(nèi)生細(xì)菌HB1310的基因組進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果顯示，該細(xì)菌的基因組為一條長(zhǎng)4.1Mb的染色體，GC含量為43

5、.5％。該基因組共預(yù)測(cè)到4314個(gè)CDSs，其中3351(77.7％)個(gè)CDSs編碼的產(chǎn)物具有明確的功能?；贙EGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的代謝途徑，詳細(xì)分析了糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑和脂肪酸合成途徑，初步闡明了該菌株發(fā)酵棉稈水解糖液時(shí)木糖進(jìn)入磷酸戊糖途徑進(jìn)行代謝的途徑，并指出其脂肪酸合成酶FAS關(guān)鍵基因可能關(guān)聯(lián)了菌株中大部分飽和及不飽和脂肪酸的合成。
　　基于基因組注釋的KEGG代謝途徑和菌株產(chǎn)油、基質(zhì)利用特性，對(duì)擬存在的代謝途徑中的關(guān)鍵

6、節(jié)點(diǎn)代謝物進(jìn)行了通量計(jì)算和代謝流的分析。在磷酸戊糖途徑中引入了從木糖到木酮糖這一反應(yīng)，為菌株對(duì)棉稈水解糖液中葡萄糖和木糖的利用給出了合理的分析。同時(shí)分析了菌株HB1310脂肪酸合成的關(guān)鍵酶及與油脂合成的關(guān)系，結(jié)果表明，脂肪酸合成酶(FAS)活性與菌株油脂產(chǎn)量呈高的正相關(guān)關(guān)系，說明脂肪酸合成酶對(duì)該菌株的油脂合成起正調(diào)控作用。本研究還基于穩(wěn)定期(48h)的代謝途徑構(gòu)建了代謝網(wǎng)絡(luò)，通過全代謝途徑通量分析表明，此時(shí)菌株代謝網(wǎng)絡(luò)中的碳架主要流向了