寡聚精氨酸納米復(fù)合物的構(gòu)建和評價(jià).pdf

1、目的：RNA干擾（RNA interference，RNAi）的發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是生物學(xué)中最重要的發(fā)現(xiàn)之一。許多類型的疾病，包括病毒感染、癌癥等已被證實(shí)可作為RNAi治療的潛在目標(biāo)。在近十幾年來，RNAi在基因功能和基因治療方面的研究越來越受到人們的關(guān)注，逐漸發(fā)展成為一種較為成熟的技術(shù)。但是，裸露 siRNA穩(wěn)定性差，易被體內(nèi)的核酸酶降解，且自身的性質(zhì)，如分子量高、負(fù)電性、親水性等阻礙了其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，極大地限制了siRNA的進(jìn)一步應(yīng)用。因此如

2、何高效地運(yùn)輸 siRNA至靶細(xì)胞并有效的穿過細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞質(zhì)中成為人們研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞穿膜肽是由5-30個(gè)氨基酸組成的陽性或兩性的短肽，具有轉(zhuǎn)染活性高，生物活性好，低毒性等優(yōu)點(diǎn)，而且其自身不僅能夠高效的穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，也可以介導(dǎo)其他外源性的分子進(jìn)入細(xì)胞，是目前快速發(fā)展的一種新型藥物載體。最近，細(xì)胞穿膜肽用于 siRNA的細(xì)胞遞送已經(jīng)逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。但是作為 siRNA的運(yùn)輸載體，細(xì)胞穿膜肽的攝取效率低，且不易從內(nèi)涵體內(nèi)逃出

3、，極大地限制了細(xì)胞穿膜肽的應(yīng)用。因此，為了提高 siRNA攝取效率，需要對細(xì)胞穿膜肽進(jìn)行修飾，使其能與siRNA更好地復(fù)合，使制劑更穩(wěn)定，攝取效率大大提高。本文構(gòu)建了寡聚精氨酸（R8）與siRNA的納米復(fù)合物，經(jīng)過硬脂?；途垡叶蓟謩e合成了 STR-R8和 STR-R8-PEG兩種不同的載體材料，制備了STR-R8/siRNA、STR-R8-PEG/siRNA和STR-R8-PEGn/siRNA三種不同的納米復(fù)合物。通過粒徑、電位、

4、電泳行為等評價(jià)不同處方的納米復(fù)合物，篩選出理化性質(zhì)優(yōu)良的處方。并以 MCF-7、HT-1080和 Hela細(xì)胞為模型，考察載體與細(xì)胞之間相互作用。
　　方法：通過查閱文獻(xiàn)及試驗(yàn)，確定了壓縮材料STR-R8和STR-R8-PEG的合成和純化方法。在室溫條件下，將SA-NHS與CPP攪拌反應(yīng)30 min，純凈水透析24 h，冷凍干燥后的產(chǎn)物即為STR-R8。在室溫條件下，將STR-R8與mPEG2000-Mal避光反應(yīng)24 h，純凈水

5、透析24 h，冷凍干燥后的產(chǎn)物即為STR-R8-PEG。通過MS對該合成產(chǎn)物進(jìn)行表征。通過參考文獻(xiàn)和大量預(yù)試驗(yàn)，以 siRNA為模型藥物，篩選納米復(fù)合物的處方。以制劑的粒徑、電位和瓊脂糖凝膠的電泳行為等為指標(biāo)，考察制劑的理化性質(zhì)，篩選出最佳的制劑處方。以MCF-7、HT-1080和Hela為細(xì)胞模型，通過流式細(xì)胞儀定量分析評價(jià)細(xì)胞攝取率，通過倒置熒光顯微鏡觀察納米復(fù)合物在細(xì)胞中的分布以及定位。
　　結(jié)果：通過質(zhì)譜結(jié)果分析，合成得到

6、了STR-R8和STR-R8-PEG。此方法條件溫和，方法簡單快捷。通過純化能夠得到純度較高的產(chǎn)物。以siRNA為模型藥物，通過室溫孵育的方法，能夠簡單快捷的制備siRNA納米復(fù)合物。以粒徑、電位和凝膠電泳行為為指標(biāo)，得出STR-R8處方的粒徑在200 nm以內(nèi)，PdI比較均勻，N/P值大于等于20時(shí)，能夠很好的包裹siRNA；STR-R8-PEG處方粒徑在300 nm左右，PdI均勻， N/P值等于20時(shí)，仍不能將 siRNA完全包裹

7、；因此考慮將 STR-R8和STR-R8-PEG兩種載體材料按一定比例混合，制備復(fù)合載體材料STR-R8-PEGn。經(jīng)過大量試驗(yàn)最終篩選出的最佳處方為N/P比均為20的STR-R8/siRNA和STR-R8-PEG20％/siRNA。通過流式細(xì)胞儀的結(jié)果可知：在MCF-7和HT-1080兩種細(xì)胞中，與游離 siRNA相比，STR-R8和 STR-R8-PEG20%均能夠大大地提高 siRNA的細(xì)胞攝取率。且兩種載體作用于MCF-7細(xì)胞后

8、，其細(xì)胞攝取率均能夠達(dá)到市售試劑的水平。對于HT-1080細(xì)胞，細(xì)胞攝取率呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，即給藥時(shí)間越長，細(xì)胞攝取率越大。但對于MCF-7細(xì)胞，在給藥2 h后，細(xì)胞攝取率達(dá)到最大，之后隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞攝取率逐漸降低。通過倒置熒光顯微鏡可知：STR-R8和STR-R8-PEG20%均能夠很好地介導(dǎo)siRNA進(jìn)入細(xì)胞，并將siRNA定位在細(xì)胞質(zhì)中。
　　結(jié)論：STR-R8和STR-R8-PEG合成方法簡單快捷，條件溫和，產(chǎn)物中雜質(zhì)