負(fù)載姜黃素的海藻酸酯納米粒的制備、表征及功能評價(jià).pdf

1、將天然多糖疏水化改性后利用分子自組裝原理制備納米級藥物運(yùn)載系統(tǒng)(drug delivery system，DDS)、納米級營養(yǎng)運(yùn)載系統(tǒng)(nutrient delivery system，NDS)已經(jīng)在纖維素、淀粉、環(huán)糊精、右旋糖酐等常規(guī)多糖和殼聚糖這種海洋生物多糖中得到了廣泛應(yīng)用，而對海藻酸進(jìn)行疏水改性的研究相對較少。鑒于海藻酸糖鏈中存在豐富的羧基(-COOH)，疏水化改性常規(guī)的思路有以酯鍵(-COO-)、肽鍵(-CONH-)等將疏水化

2、分子接枝到糖鏈上。在本實(shí)驗(yàn)室以酯鍵(-COO-)接枝的嘗試中，采用了油酸基團(tuán)。油酸是不飽和脂肪酸，是一種對人體有益的營養(yǎng)物質(zhì)。以油酸和PCl3反應(yīng)制備油酰氯，油酰氯再與海藻酸粉末發(fā)生非均相反應(yīng)制備油酰疏水化海藻酸(OAE)來制備兼性材料是最先考慮的思路。但是這種合成方法存在一定的缺點(diǎn)：①油酸粘性大，因此在與海藻酸反應(yīng)時(shí)粘滯阻力大，影響了反應(yīng)速率和產(chǎn)率。而且，由于海藻酸對熱(>100℃)并不穩(wěn)定，一味地提高溫度并不可行。②海藻酸存在很多由

3、復(fù)雜氫鍵系統(tǒng)形成的微晶結(jié)構(gòu)，因此難溶于水，在非均相改性時(shí)容易造成改性表面化、不均勻、取代度低的缺點(diǎn)。改性不均勻使得后續(xù)性質(zhì)探究、包埋存在一定的偶然性、不可重復(fù)性。③制備過程中采用了PCl3，毒性大，使得反應(yīng)過程有一定危險(xiǎn)性，也對制備的儀器提出了很高的要求。而且，制備的油酰氯也存在一定毒性。鑒于以上缺點(diǎn)，本論文擬采用另一種制備思路。
　　 本論文擬采用活潑的油酸甲酯以轉(zhuǎn)酯化的方式將將油酸基接枝到海藻酸上。溶劑方面，經(jīng)篩選，采用海藻

4、酸溶解能力強(qiáng)、化工中應(yīng)用普遍的的甲酰胺。甲酰胺作為溶劑具有優(yōu)良的溶解能力，常用作纖維軟化劑、動物膠軟化劑等。甲酰胺也是超低溫保存組織和器官時(shí)用到的玻璃化冷凍液中的重要組分，具有一定的生物相容性。與以往的非均相反應(yīng)相比，甲酰胺破壞了海藻酸中復(fù)雜氫鍵(hydrogenbond)系統(tǒng)形成的微晶結(jié)構(gòu)，使海藻酸能很好地溶解。油酸甲酯與甲酰胺互溶，且油酸甲酯粘度遠(yuǎn)低于油酸，從而使油酸基能夠更容易地接近糖鏈的反應(yīng)基團(tuán)，使得反應(yīng)易于發(fā)生。另外，油酸甲酯

5、須在-20℃冷凍保存，性質(zhì)不穩(wěn)定，易分解形成油酸和甲醇。反應(yīng)溫度65℃高于甲醇的沸點(diǎn)，產(chǎn)生的甲醇易揮發(fā)除去，從而促進(jìn)反應(yīng)右移增加產(chǎn)率。經(jīng)測定，OA耦合物取代度11.78％，與采用油酰氯合成的OAE取代度(0.84，2.60，3.85％)相比，取代度大為提高。
　　 經(jīng)紅外光譜(FTIR)、核磁共振譜(1HNMR)分析確證了耦合物的共價(jià)連接。
　　 合成的油酸-海藻酸耦合物(oleate-alginic acid Coni

6、ugate，OA)，溶解度較高便于配制高濃度納米微膠囊制劑；能被Ca2+交聯(lián)，但弱于海藻酸鈉的交聯(lián)性能；OA水溶液呈弱酸性且酸性弱于海藻酸(AA，alginic acid)，而姜黃素在酸性pH下更穩(wěn)定，因此OA具有高效高劑量負(fù)載姜黃素、提高姜黃素貯存穩(wěn)定性的潛質(zhì)。
　　 經(jīng)X射線衍射(XRD)分析，OA不同于海藻酸，由復(fù)雜氫鍵系統(tǒng)形成的微晶大大減少，衍射峰形與海藻酸鈉有一定相似性。差示掃描量熱法(DSC)顯示，與海藻酸(AA)、

7、海藻酸鈉(SA)、油酰疏水化海藻酸(OAE)相比，OA具有獨(dú)特的熱學(xué)性質(zhì)，且與SA相似性更大。臨界聚集濃度(CAC)結(jié)果顯示，OA耦合物材料具有較低的CAC，因此分子易于發(fā)生自組裝。經(jīng)由溶解、超聲、均質(zhì)方法制備了空白納米粒，發(fā)現(xiàn)僅僅在溶解的條件下OA就已經(jīng)分散形成了納米級的顆粒物，盡管多分散系數(shù)(PDI)偏大。隨著高速均質(zhì)速率的上升，納米粒粒徑逐漸減小。與均質(zhì)相比，超聲條件制備的納米粒溶液粒徑小、大小均一、體系穩(wěn)定。
　　 制備

8、的負(fù)載姜黃素的OA納米粒溶液透明、體系均一、穩(wěn)定性較好。OA納米粒具有很好的攜載性能，包封率(EE)和載藥量(LE)較高。體外緩釋效能顯示，與自由姜黃素相比，納米粒表現(xiàn)出一定的緩釋能力，5天后藥物釋放率達(dá)到峰值85％，而自由姜黃素在12h左右就已經(jīng)達(dá)到了峰值。
　　 納米粒對MCF-7細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)(MTT)顯示，空白OA耦合物納米粒在各濃度(250、500、1000μg/ml)、各粒徑(265、390、621nm)下，對MC

9、F-7細(xì)胞毒性不大，說明材料本身是安全無毒的，細(xì)胞相容性良好。
　　 負(fù)載姜黃素的OA納米粒對MCF-7細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)(MTT)顯示，隨著載藥量的增加(6.26％、15.37％、24.55％)和載藥納米粒濃度的增加(125、250、500、1000μg/ml)，OA納米粒對細(xì)胞殺傷作用逐漸增強(qiáng)。載藥量24.55％、500μg/ml的納米粒溶液殺傷作用大致相當(dāng)于62.5μg/ml的自由姜黃素甲醇溶液。這可能是由于納米粒中的姜黃素

10、是以緩慢釋放的形式對細(xì)胞施加殺傷作用，是一種長效殺傷機(jī)制，截至終止處理時(shí)還有相當(dāng)?shù)慕S素未被釋放；而自由姜黃素甲醇溶液是以足量、劇烈的形式對細(xì)胞施加殺傷作用，短期殺傷效果明顯。
　　 由于姜黃素具有受激發(fā)后自發(fā)熒光的優(yōu)點(diǎn)，OA納米粒不像其他藥物和載藥體系那樣需要FITC的標(biāo)記才能在熒光顯微鏡下觀察納米粒進(jìn)入細(xì)胞的過程和數(shù)量，這給實(shí)驗(yàn)帶來了極大的便利。熒光照片結(jié)果顯示，與姜黃素甲醇溶液快速進(jìn)入MCF-7細(xì)胞相比，負(fù)載姜黃素的OA耦

11、合物納米粒相對緩慢，60min時(shí)達(dá)到熒光峰值。姜黃素進(jìn)入細(xì)胞的形式有兩種，一種是納米粒釋出的姜黃素從胞外進(jìn)入胞內(nèi)，另一種是納米粒被細(xì)胞內(nèi)吞到細(xì)胞中。在不同的載藥納米粒濃度(125、250、500μg/ml)下，濃度越高，越有助于納米粒較快地進(jìn)入MCF-7細(xì)胞。在不同的孵育溫度下，4℃低溫時(shí)，載藥納米粒進(jìn)入細(xì)胞的速率大大減緩，原因可能是在低溫下，MCF-7細(xì)胞的新陳代謝功能減弱，因此對納米粒的攝取效能減弱。但還不能確定納米粒的攝取是否需要