蒙藥忠倫阿湯治療RA的免疫機制研究.pdf

1、第一部分：動物實驗
　　實驗一：忠倫阿湯治療CIA大鼠的療效觀察
　　目的：觀察及評價忠倫阿湯對CIA大鼠的療效。
　　方法：SD大鼠于第1天和第7天注射II型膠原蛋白進行造模，取造模成功的大鼠隨機分為模型組（model）、甲氨蝶呤組（MTX）、忠倫阿湯高劑量組（zhongl hd）、忠倫阿湯中劑量組（zhongl md）、忠倫阿湯低劑量組（zhongl ld）、苦參堿組（matrine）.于第一次免疫第11天開始灌胃

2、給藥，正常組生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥6周。每周測量大鼠體重、后腳掌的厚度并進行關節(jié)炎指數(shù)評分。
　　結果：模型組大鼠后腳掌的厚度、腫脹度、關節(jié)炎指數(shù)顯著增高(P＜0.05)，苦參堿、忠倫阿湯劑量依賴性的顯著降低大鼠后腳掌厚度和關節(jié)炎指數(shù)，忠倫阿湯高劑量組優(yōu)于MTX組(P＜0.05)。
　　結論:忠倫阿湯可顯著緩解RA大鼠關節(jié)炎癥。
　　實驗二：忠倫阿湯對CIA大鼠Th1、Th2細胞分化的調(diào)控作用
　　目的:觀察忠倫

3、阿湯對CIA大鼠Th1和Th2細胞分化的調(diào)控作用
　　方法:SD大鼠分組給藥同實驗一。灌胃6周后取材：
　　1.流式細胞術檢測外周血Th1、Th2細胞；
　　2.RT-PCR檢測IFN-γ和IL-4 mRNA的表達；
　　3.ELISA檢測血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-4和 IL-10蛋白的表達。
　　結果：模型組與正常組比較，Th1細胞百分比以及其分泌的細胞因子IFN-γ mRNA和蛋白、

4、IFN-r、TNF-α、IL-1β蛋白水平和Th1/Th2比值明顯升高，Th2細胞百分比及其分泌的細胞因子IL-4 mRNA和蛋白、IL-4和IL-10蛋白水平明顯下調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，苦參堿和忠倫阿湯劑量依賴性的抑制這一過程（P＜0.05），以忠倫阿湯高劑量組作用最顯著，對Th1、Th2細胞分化和IL-4的表達的調(diào)節(jié)優(yōu)于MTX組（P＜0.05）。
　　結論：忠倫阿湯能調(diào)節(jié)Th1和Th2細胞的平衡以及相關細胞因子的表

5、達，抑制RA關節(jié)炎癥。
　　實驗三：忠倫阿湯對CIA大鼠Treg和Th17細胞的調(diào)控作用
　　目的：觀察忠倫阿湯對CIA大鼠Treg和Th17細胞分化的調(diào)控作用
　　方法：SD大鼠分組給藥同實驗一。灌胃6周后取材：
　　1.流式細胞術檢測外周血Treg細胞、Th17細胞的百分比；
　　2.RT-PCR檢測Foxp-3、TGF-β、IL-6和IL-17 mRNA表達；
　　3.ELISA檢測血清TGF-

6、β、IL-6和IL-17蛋白水平。
　　結果:與正常組比較，模型組 Th17細胞百分比以及其分泌的細胞因子IL-6和IL-17 mRNA和蛋白水平明顯升高，Treg細胞百分比及其分泌的細胞因子 TGF-β mRNA和蛋白水平明顯下調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，苦參堿和忠倫阿湯劑量依賴性的調(diào)節(jié)異常Treg細胞、Th17細胞的分化（P＜0.05），以忠倫阿湯高劑量組作用最顯著，對TGF-β、IL-4mRNA表達的調(diào)節(jié)優(yōu)于MTX組，

7、對Treg細胞分化、IL-17mRNA表達的調(diào)節(jié)弱于MTX組（P＜0.05）。
　　結論：忠倫阿湯通過調(diào)節(jié)CIA大鼠Treg細胞和Th17細胞的平衡以及相關細胞因子的表達，從而抑制RA關節(jié)炎癥。
　　實驗四：忠倫阿湯對CIA大鼠NF-kappaB信號通路的調(diào)控作用
　　目的：觀察忠倫阿湯干預CIA大鼠后NF-kappaB信號通路相關因子的表達，研究忠倫阿湯調(diào)節(jié)RA的免疫機制。
　　方法：SD大鼠分組給藥同實驗一。

8、灌胃6周后分離外周血T細胞，通過Western-blot法檢測細胞p65、p-Iκ Bα、Iκ Bα蛋白的表達。
　　結果：模型組 p65、p-IkBα蛋白的表達較正常組明顯升高（P＜0.05）?？鄥A和忠倫阿湯劑量依賴性的下調(diào)模型組p65、p-IkBα表達，但弱于 MTX組（P＜0.05）。各組間 IkBα表達未見明顯差異（P＞0.05）。提示忠倫阿湯可能抑制T細胞NF-kappaB通路的活化以調(diào)節(jié)T細胞亞群的分化，從而治療RA

9、。
　　結論：忠倫阿湯通過抑制 NF-kappaB信號通路活化以調(diào)節(jié) RA T細胞亞群的分化。
　　第二部分：細胞實驗
　　實驗五：忠倫阿湯對體外培養(yǎng)T細胞分泌的細胞因子表達的影響
　　目的：觀察忠倫阿湯對T細胞因子表達的影響
　　方法：小鼠T細胞中加入佛波醇酯（PMA）和離子霉素(Ion)
　　以不同終濃度的忠倫阿湯含藥血清與T細胞共同培養(yǎng),MTT法選擇最佳濃度,納入后續(xù)實驗，
　　實驗分組：

10、
　　正常組：
　　模型組：T淋巴細胞+PMA+Ion
　　CH828組：T淋巴細胞+PMA+Ion+1μ M CHS828
　　MTX組：T淋巴細胞+PMA+Ion+MTX
　　苦參堿組：T淋巴細胞+PMA+Ion+苦參堿
　　忠倫阿湯組： T淋巴細胞+PMA+Ion+25%忠倫阿湯含藥血清
　　忠倫阿湯+CHS828組:T淋巴細胞+PMA+Ion+25%忠倫阿湯含藥血清+1μ M CHS82

11、8
　　苦參堿+CHS828組：.T淋巴細胞+PMA+Ion+25%苦參堿+1μ M CHS828
　　培養(yǎng)72小時，收集細胞。
　　RT-PCR法檢測忠倫阿湯含藥血清干預T細胞后，T細胞因子IFN-γ、IL-4、 Foxp-3、TGF-β、IL-6、RORyt和 IL-17mRNA的表達；
　　1.ELISA法檢測忠倫阿湯含藥血清干預 T細胞后，T細胞因子IL-6、TGF-β、IFN-γ、TNF-a、IL-1β

12、、IL-4、 IL-10和IL-17蛋白表達
　　結果:1、MTT法測定T細胞增殖，PMA的濃度為10ng/mL,lon濃度為1μ M促增殖作用最強，25%濃度忠倫阿湯24h抑制T細胞增殖作用達到0.501523%，可用于后續(xù)實驗（P＜0.05）。
　　2、RT-PCR法檢測顯示，模型組 Foxp-3、IL-4、TGF-β mRNA水平顯著降低，IFN-γ、IL-6、RORyt和 IL-17mRNA水平顯著升高，提示模型組T

13、細胞分化失衡（P＜0.05），與模型組相比，可被忠倫阿湯含藥血清組和苦參堿明顯抑制（P＜0.05）。忠倫阿湯調(diào)節(jié)Foxp-3、IL-6表達的能力優(yōu)于MTX（P＜0.05），其他細胞因子調(diào)節(jié)和MTX無明顯差異（P＞0.05）?？鄥A對細胞因子的影響弱于MTX（P＜0.05），提示中藥單體的作用弱于復方制劑。當加入NF-kappaB信號通路特異抑制劑CHS828，模型組細胞因子的變化被抑制劑顯著抑制（P＜0.05）。當追加苦參堿或忠倫阿湯后

14、，藥物+抑制劑組的調(diào)節(jié)作用明顯優(yōu)于單獨抑制劑組（P＜0.05）。
　　3、ELISA法檢測所示，模型組和正常組比較IL-4、TGF-β和IL-10蛋白水平顯著降低，TNF-a、IL-1β、IFN-γ、IL-6和 IL-17蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。當忠倫阿湯含藥血清組和苦參堿干預后，與模型組相比，此作用被明顯抑制（P＜0.05），同時被NF-kappaB信號通路特異抑制劑CHS828明顯抑制（P＜0.05）。當追加苦參堿或

15、忠倫阿湯含藥血清后，藥物+抑制劑組的調(diào)節(jié)作用明顯優(yōu)于單獨抑制劑組（P＜0.05），提示苦參堿和忠倫阿湯含藥血清調(diào)節(jié) RA T細胞分化不僅限于NF-kappaB信號通路。
　　結論：忠倫阿湯具有免疫調(diào)節(jié)作用,可恢復T細胞因子的平衡，從而治療RA。
　　實驗六：忠倫阿湯對體外培養(yǎng)的T細胞NF-kappaB信號通路的影響
　　目的：觀察忠倫阿湯對體外培養(yǎng)的T細胞NF-kappaB信號通路活化的影響。
　　方法：T細胞分

16、離，分組同實驗5，培養(yǎng)72小時，收集細胞，采用Western blot方法檢測T細胞p65、p-IκBα和IκBα蛋白的表達。
　　結果：模型組較正常組比較，刺激T細胞后，p65、p-IkBα蛋白表達明顯升高（P＜0.05），IkBα含量無明顯變化（P＞0.05）。當加入NF-kappaB通路抑制劑CHS828時，通路明顯被抑制（P＞0.05）。忠倫阿湯含藥血清組和苦參堿能顯著下調(diào)模型組 T細胞 p65、p-IkBα蛋白水平，抑制