麥芽中酵母超前絮凝(PYF)活力新評(píng)價(jià)指標(biāo)的建立與應(yīng)用研究.pdf

1、麥芽PYF（酵母超前絮凝）因子是麥芽中含有的某種可以影響酵母絮凝性能的多糖物質(zhì)，會(huì)在啤酒后熟期導(dǎo)致酵母發(fā)生提前絮凝(Premature Yeast Flocculation，PYF)現(xiàn)象，從而引發(fā)發(fā)酵不完全、成熟度差等嚴(yán)重質(zhì)量后果。
　　目前國(guó)內(nèi)外各大啤酒集團(tuán)為了保證同一啤酒品牌多地生產(chǎn)的口味一致性，在麥芽采購(gòu)方面均實(shí)行集中管理、統(tǒng)一采購(gòu)，年進(jìn)口采購(gòu)量達(dá)百萬(wàn)噸。如果一旦采購(gòu)到有PYF問(wèn)題的麥芽將直接影響到數(shù)十家啤酒廠的酵母生理狀態(tài)

2、及發(fā)酵過(guò)程的釀造性能，并最終對(duì)啤酒成品的風(fēng)味一致性產(chǎn)生極大的負(fù)面影響，隨之造成的經(jīng)濟(jì)損失及聲譽(yù)損失不可估量。
　　意識(shí)到這一問(wèn)題的嚴(yán)重性后，啤酒制造企業(yè)也逐漸嘗試把麥芽PYF指標(biāo)納進(jìn)麥芽采購(gòu)評(píng)價(jià)里，并根據(jù)各自酵母的絮凝敏感特性及生產(chǎn)質(zhì)量需求來(lái)設(shè)定麥芽PYF指標(biāo)采購(gòu)標(biāo)準(zhǔn)。然而目前通行的麥芽PYF活力評(píng)價(jià)方法都必須依賴(lài)酵母的絮凝表現(xiàn)來(lái)間接評(píng)價(jià)，其反映的是麥芽PYF活力、酵母絮凝性能以及活力狀態(tài)對(duì)酵母絮凝表現(xiàn)的一個(gè)綜合指標(biāo)，缺乏客觀性而

3、不被麥芽制造商所認(rèn)可;同時(shí)由于各啤酒集團(tuán)使用的酵母菌種絮凝性差異非常大，依賴(lài)于各自菌種特性建立的麥芽PYF活力檢測(cè)方法各成體系，這也給把麥芽PYF指標(biāo)納入采購(gòu)標(biāo)準(zhǔn)帶來(lái)了一定的障礙。
　　因此本研究從對(duì)麥芽PYF多糖的提取純化著手，首次利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)技術(shù)建立一種快速、靈敏、適應(yīng)于現(xiàn)場(chǎng)的麥芽PYF活力分析方法，該檢測(cè)方法及操作系統(tǒng)穩(wěn)定性較好，可信度較高，有別于目前使用的PYF活力檢測(cè)方法需要利用酵母的特點(diǎn)，可轉(zhuǎn)化應(yīng)用為一種客觀

4、、適應(yīng)于第三方評(píng)估的麥芽大宗采購(gòu)質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo);并通過(guò)對(duì)不同批次麥芽PYF活力的實(shí)際應(yīng)用檢測(cè)，對(duì)麥芽PYF的誘發(fā)機(jī)理與調(diào)控機(jī)制展開(kāi)初步探索，形成一條從基礎(chǔ)到應(yīng)用的縱向研究體系。
　　主要研究成果如下:
　　(1)首先根據(jù)測(cè)定應(yīng)用酵母的絮凝特性分別從酵母懸浮液的初始濃度、緩沖體系的pH值、鈣離子濃度幾個(gè)方面對(duì)麥芽PYF微量光密度測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化改良，建立了一種快速、靈敏的適用于判定微量樣品麥芽PYF活力的方法，用以判定麥芽PYF

5、多糖各提純步驟的純化效率。
　　(2)依據(jù)麥芽PYF多糖是以極其松散的方式結(jié)合在酵母細(xì)胞壁之間、極易被洗脫的性質(zhì)特點(diǎn)，利用PYF強(qiáng)陽(yáng)性麥芽進(jìn)行發(fā)酵，然后以酵母泥為吸附基團(tuán)，通過(guò)NaCl溶液對(duì)回收酵母的洗脫建立了一種快速、高效的麥芽PYF粗多糖提取方式。
　　利用切向流超濾技術(shù)對(duì)麥芽PYF多糖粗提液進(jìn)行大幅度的濃縮、除鹽及小分子糖類(lèi)的祛除，然后利用DEAE-Sephadex A-25離子交換樹(shù)脂及Sephadex G-100葡

6、聚糖凝膠柱層析等處理進(jìn)行純化。
　　通過(guò)紫外吸收光譜掃描、SDS-PAGE試驗(yàn)分析此種多糖含有蛋白結(jié)構(gòu)，分子量約為40kDa。但通過(guò)脫蛋白試驗(yàn)表明蛋白成分不是引發(fā)PYF現(xiàn)象的必要組成部分。最后利用高效液相色譜技術(shù)鑒定證明得到了一種麥芽PYF純品，加入到酵母細(xì)胞中后能夠顯著的促進(jìn)酵母的絮凝。
　　(3)分別以牛血清白蛋白(BSA)和匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)為載體，采用高碘酸鈉法合成了麥芽PYF多糖的完全抗原，并利用紫外可見(jiàn)光譜掃

7、描方法證明完全抗原合成成功。
　　(4)利用PYF-BSA制備包被抗原，PYF-KLH制備免疫抗原，通過(guò)免疫Balb/c小鼠和新西蘭大白兔制備抗體，利用間接ELISA檢測(cè)兩種抗血清的效價(jià)分別可達(dá)1∶25600和1∶204800。并以兔多抗為基礎(chǔ)通過(guò)ELISA最佳反應(yīng)條件的建立、麥芽檢測(cè)樣品制備方法的優(yōu)化，初步建立了一套適用于實(shí)際麥芽樣品PYF多糖競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析方法的操作程序，其中競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)體系的主要工作參數(shù)為:包被抗原

8、濃度為50μg/mL，兔抗血清稀釋度為10000倍，酶標(biāo)二抗稀釋度為10000倍。
　　(5)從生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)選取不同麥芽樣品分別利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析方法和原來(lái)使用的快速發(fā)酵法進(jìn)行了重復(fù)性、重現(xiàn)性及靈敏度試驗(yàn)的對(duì)比驗(yàn)證，證明麥芽PYF因子競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法其重復(fù)性及重現(xiàn)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于快速發(fā)酵法，其變異系數(shù)分別小于5％和10％，說(shuō)明該檢測(cè)方法及操作系統(tǒng)穩(wěn)定性較好，可信度較高。
　　(6)根據(jù)麥芽PYF值對(duì)本論文所選用酵母絮凝性能的

9、影響程度，建立以競(jìng)爭(zhēng)ELISA法為依據(jù)的麥芽采購(gòu)建議標(biāo)準(zhǔn)如下:
　　麥芽樣品OD450小于0.513的可判定為PYF強(qiáng)陽(yáng)性麥芽，說(shuō)明此批麥芽對(duì)酵母絮凝性能有較大影響，不予接受;
　　麥芽樣品OD450處于0.513～0.579之間的可判定為PYF弱陽(yáng)性麥芽，說(shuō)明此批麥芽對(duì)酵母絮凝性能有一定影響，可商定折價(jià)采購(gòu);
　　麥芽樣品OD450大于0.579的可判定為PYF陰性麥芽。
　　(7)綜合利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法和快

10、速發(fā)酵法初步探討了麥芽搭配、洗麥、剝皮等降低麥芽PYF活力工藝措施的可行性。其中麥芽洗滌、原料除塵及剝皮可有效降低麥芽PYF活力，并充分證明了麥芽PYF多糖極易溶于水，且在水中保留了導(dǎo)致酵母產(chǎn)生PYF潛力的研究觀點(diǎn)。
　　同時(shí)發(fā)現(xiàn)麥芽PYF活力不具備簡(jiǎn)單的加和性，因此進(jìn)行麥芽搭配時(shí)，不能單純依靠計(jì)算理論值來(lái)判定搭配后的麥芽PYF活力，必須對(duì)配方麥芽重新進(jìn)行PYF活力檢測(cè);不同PYF強(qiáng)度的麥芽與PYF陰性麥芽搭配時(shí)，其對(duì)配方麥芽PY