脂肪酶催化合成(S)-吲哚洛芬及其與小分子相互作用機理.pdf

1、2-芳基丙酸(2-arylpropanoic acid，2-APA)類手性藥物是一類重要的消炎、鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕藥物，其α-C為手性碳原子，(S)-對映體具有較強消炎鎮(zhèn)痛作用，(R)-對映體活性低或無活性。吲哚洛芬是此類藥物的典型代表之一，手性拆分外消旋吲哚洛芬合成(S)-吲哚洛芬具有重要現(xiàn)實意義。微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源，皺褶假絲酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase,CRL)是其重要品種之一，具有較高酶活性和

2、穩(wěn)定性，可催化酯水解、酯交換、酯合成等反應(yīng)，在油脂加工、食品、醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景和較高商業(yè)價值。特別是在手性化合物酶促不對稱合成中具有不可替代的作用。本論文以脂肪酶催化酯對映體選擇性水解合成(S)-吲哚洛芬為主線，分子對接虛擬篩選脂肪酶底物、優(yōu)化脂肪酶對映體選擇性水解反應(yīng)條件、探討小分子乙醛和金屬離子與脂肪酶分子相互作用機理以及對脂肪酶對映體選擇性的調(diào)控，在此基礎(chǔ)上探討有機相脂肪酶催化對映體選擇性水解拆分反應(yīng)動力學(xué)模型，為脂

3、肪酶工業(yè)應(yīng)用提供依據(jù)和技術(shù)支撐。
　　基于生物大分子與小分子配體識別與作用規(guī)律，本文利用分子對接軟件AutoDock4.2.5預(yù)測11種2-2-APA類底物在CRL活性口袋中的結(jié)合模式，可視化解析CRL2-2-APA乙酯復(fù)合物空間構(gòu)象和2-APA乙酯與CRL氨基酸殘基的結(jié)合位點；根據(jù)自由結(jié)合能打分和分簇聚類結(jié)果，篩選出用于后續(xù)試驗的最佳底物，為脂肪酶家族的催化機理提供理論依據(jù)。CRL催化拆分2-APA乙酯合成(S)-2-APA結(jié)果

4、和分子對接理論研究結(jié)果基本一致，兩者相互補充，從實驗和理論兩方面協(xié)同研究了2-APA配體底物與CRL間的相互作用。篩選出吲哚洛芬乙酯為CRL催化2-APA乙酯手性合成(S)-2-APA的最佳底物。分子對接虛擬篩選CRL最佳拆分底物的研究少有報道。
　　研究了非水介質(zhì)中吲哚洛芬乙烯酯酶促不對稱水解合成(S)-吲哚洛芬。單因素實驗考察吲哚洛芬酯結(jié)構(gòu)、有機溶劑、底物濃度、酶濃度、反應(yīng)時間、溫度、pH、吐溫-80濃度、含水量等各種因素對酶

5、促水解拆分反應(yīng)的影響；在此基礎(chǔ)上，響應(yīng)面法研究了酶濃度、反應(yīng)時間、溫度、pH對該反應(yīng)的影響，優(yōu)化得到最佳工藝參數(shù)并經(jīng)模型驗證，確定CRL拆分吲哚洛芬乙烯酯合成(S)-吲哚洛芬的最佳反應(yīng)條件為：含水量0.16％、1.2%吐溫-80、異辛烷-甲苯(90/10)混合體系中，加入5g/L吲哚洛芬乙烯酯，175.00mg/L CRL，充分混勻后于pH7.5，38.5 oC，150rpm反應(yīng)39h，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率c和e.e.p值分別可達47.51%和9

6、8.57%，對應(yīng)E值為421.27，比優(yōu)化前提高了11.91%。跟模型預(yù)測值相比，相對誤差為1.17%(小于5%)，表明模型擬合度好，可用于CRL催化拆分IVE合成(S)-吲哚洛芬的預(yù)測。
　　乙醛是CRL水解拆分吲哚洛芬乙烯酯反應(yīng)副產(chǎn)物。乙醛對CRL水解活性表現(xiàn)出低促高抑的Hormesis現(xiàn)象，其最大激活濃度為0.2215mmol/L。紅外、紫外、熒光光譜結(jié)合動力學(xué)研究表明：0.2215mmol/L乙醛處理后CRL的-螺旋和β-

7、折疊含量增加，無規(guī)則卷曲和分子內(nèi)β-折疊聚集含量減少，CRL二級結(jié)構(gòu)趨向有序化，其活性中心微環(huán)境疏水性降低。分子對接預(yù)測CRL分子與乙醛相互作用發(fā)現(xiàn)，乙醛分子進入CRL活性口袋，通過氫鍵與其活性中心內(nèi)部的Ser209、Ser389、Trp188、Gly124、Gly342結(jié)合，并誘導(dǎo)了CRL分子內(nèi)部Gln338與Glu341間氫鍵的形成，導(dǎo)致CRL二級結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲變化。在此基礎(chǔ)上，研究發(fā)現(xiàn)開放系統(tǒng)中殘留的微量乙醛對CRL對映體選擇性幾乎

8、無影響。
　　不同類型金屬離子對CRL催化特性的影響各異。堿土金屬離子(Mg2+、Ca2+、Sr2+和Ba2+)對CRL催化活性呈現(xiàn)出相同的變化趨勢，并表現(xiàn)出類似“Hormesis”效應(yīng)的低促高抑現(xiàn)象。過渡金屬(Cu2+、Zn2+)呈現(xiàn)出低濃度輕微促進高濃度嚴重抑制的規(guī)律；Mn2+對則均表現(xiàn)為抑制作用。其中，0.01mol/L Mg2+顯著提高該CRL催化反應(yīng)的對映體選擇性。光譜學(xué)方法研究表明，0.01mol/L Mg2+可使CR

9、L在保持基礎(chǔ)二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，-螺旋和β-折疊含量小幅增加，其結(jié)構(gòu)趨向于柔性變化，增加了底物與酶活性中心接觸機會，導(dǎo)致酶活性增加。鄒氏酶活性不可逆改變底物反應(yīng)動力學(xué)模型擬合結(jié)果表明0.01mol/L Mg2+對CRL為非競爭性不可逆激活，而1mol/L Mg2+對CRL為非競爭性不可逆抑制。
　　提出非水相中CRL催化水解拆分吲哚洛芬乙烯酯反應(yīng)符合存在底物和產(chǎn)物抑制的不可逆Ping-Pong Bi-Bi反應(yīng)機制。在理想狀態(tài)CRL酶