恩拉霉素生產(chǎn)菌的選育及其發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、恩拉霉素(enramycin)是放線菌(Streptomyces fungicidious)分泌的,由不飽和脂肪酸與十幾種氨基酸結(jié)合的多肽類抗生素。主要成分為恩拉霉素A和恩拉霉素B,還含有少量的恩拉霉素C和D。恩拉霉素對革蘭氏陽性菌有良好的抗菌作用,通過抑制其細(xì)胞壁前聚物質(zhì)的合成來影響生物體,特別是對腸內(nèi)的有害梭狀芽孢桿菌(Clostridium)抑制力很強(qiáng)。因其能起到良好的促生長作用,目前作為飼料添加劑使用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。本文對Stre

2、ptomyces fungicidious KS010菌株發(fā)酵產(chǎn)恩拉霉素進(jìn)行了初步研究,主要包括恩拉霉素測定方法的建立、高產(chǎn)恩拉霉素菌株的選育、恩拉霉素發(fā)酵條件的優(yōu)化及上罐培養(yǎng)等內(nèi)容。
　　 首先優(yōu)化了恩拉霉素的微生物檢定法和高效液相色譜法的檢定條件,建立了測定恩拉霉素的微生物檢定法和高效液相色譜法(HPLC)標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過浸提溶液組成、浸提時間、檢定菌濃度考察,優(yōu)化了微生物檢定法的檢定條件。在檢定條件為丙酮浸提液B(丙酮:2m

3、ol/L鹽酸:水=20:1:21)、浸提時間80min、檢定菌濃度106個/mL的情況下,建立恩拉霉素微生物檢定法標(biāo)準(zhǔn)曲線。恩拉霉素濃度在0.56-35.79U/mL之間,其濃度的對數(shù)值與相應(yīng)的抑菌圈直徑呈直線相關(guān);回歸方程為Y=0.2436X-3.47436,相關(guān)系數(shù)r為0.9960。通過流動相配比、流速和浸提時間的考察,優(yōu)化了HPLC的檢定條件。在色譜條件為檢測波長267nm,流動相為乙腈:50mM KH2PO4(30:70),流速

4、為0.8 mL/min的情況下,建立恩拉霉素HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。恩拉霉素濃度在0.26-275.72U/mL范圍內(nèi),得到的回歸方程Y=1.83099E-6X-0.5284.6,相關(guān)系數(shù)r為0.99947。采用同種樣品,對兩種測定方法進(jìn)行比較,所得結(jié)果重復(fù)性好,準(zhǔn)確性高,都可用于含恩拉霉素的樣品測定。
　　 對出發(fā)菌株(Streptomyces fungicidious KS010)進(jìn)行NTG誘變、通過瓊脂塊法進(jìn)行初篩,獲得M-19

5、菌株,產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高32.62％。接著以該菌株為研究對象,比較了紫外復(fù)合誘變和60Co-γ復(fù)合誘變的效果,結(jié)果表明60Co-γ復(fù)合誘變優(yōu)于紫外復(fù)合誘變。從60Co-γ復(fù)合誘變正變株中獲得一株搖瓶效價達(dá)1853U/mL,較出發(fā)菌株提高68.00％的菌株。通過繼代培養(yǎng),該菌株穩(wěn)定性好,命名為Streptomyces fungicidious Co250-42。
　　 通過單因素試驗和中心組合響應(yīng)面優(yōu)化分析考察了影響Strepto

6、mycesfungicidious KS010菌株產(chǎn)恩拉霉素的因素,得到液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)恩拉霉素的最佳條件。結(jié)果表明,當(dāng)酵母浸出粉1.29％、磷酸二氫鉀濃度10.84mmol/L、氯化鋅濃度8.74mmol/L和葡萄糖5.93％時,初始pH8.0,33℃,發(fā)酵7天,其恩拉霉素效價為2065.82U/mL,較出發(fā)菌株效價(1041U/mL)提高了98.30％。
　　 以誘變菌株Streptomyices fungicidious Co2