UV-C脅迫誘導(dǎo)蝦頭自降解的機(jī)制及其調(diào)控.pdf

1、蝦頭在對蝦加工過程中經(jīng)常作為加工廢棄物處理掉，每年至少產(chǎn)生20萬噸的凡納濱對蝦蝦頭，目前凡納濱對蝦蝦頭回收利用附加值低下，多用于粗加工，精深加工較少，主要用來生產(chǎn)水產(chǎn)飼料等。蝦頭中含有豐富的內(nèi)源性蛋白酶，并且酶活較高，蝦頭在對蝦加工后容易腐爛，不僅造成了資源的浪費(fèi)，也造成一定的環(huán)境污染。蝦頭中營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，具有開發(fā)利用的價(jià)值，并且蝦頭內(nèi)源性蛋白酶經(jīng)過UV-C脅迫后，酶活力大幅度提升。
　　為了充分利用凡納濱對蝦蝦頭內(nèi)源性蛋白酶

2、，回收利用蝦頭自身蛋白質(zhì)制備短肽，增加蝦頭的附加值，本文以凡納濱對蝦蝦頭為原料，探討了UV-C脅迫對蝦頭內(nèi)源性蛋白酶酶活性的影響，并在內(nèi)源性蛋白酶活力最大的基礎(chǔ)上建立UV-C脅迫下蝦頭自降解動力學(xué)，研究了基于蝦頭內(nèi)源性酸性蛋白酶自降解過程，建立了基于蝦頭內(nèi)源性消化蛋白酶自降解制備短肽的體系，并采用Caco-2細(xì)胞模型評估自降解短肽的消化吸收性能。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)研究了pH、溫度對UV-C脅迫前后蝦頭內(nèi)源性蛋白酶酶活的

3、影響，以及專一性抑制劑對UV-C脅迫后蝦頭內(nèi)源性堿性蛋白酶和酸性蛋白酶酶活的影響，研究了硫酸銨分級沉淀UV-C脅迫前后兩種內(nèi)源性蛋白酶的最佳飽和度，并采用Sephacryl S-100分子篩對UV-C脅迫前后兩種內(nèi)源性蛋白酶純化，結(jié)果表明:凡納濱對蝦蝦頭內(nèi)源性堿性蛋白酶的最適溫度為60℃，內(nèi)源性酸性蛋白酶的最適溫度為50℃。50％飽和度硫酸銨時(shí)，UV-C脅迫后堿性蛋白酶和酸性蛋白酶酶活力均比未經(jīng)過UV-C脅迫高。UV-C脅迫后蝦頭內(nèi)源性

4、蛋白酶的分子量無明顯變化，UV-C脅迫后蝦頭內(nèi)源性堿性蛋白酶和酸性蛋白酶的分離蛋白峰比活力均有變化，部分蛋白峰比活力提高，而專一性抑制劑的抑制率下降，UV-C脅迫對不同分子量的蝦頭內(nèi)源性蛋白酶具有不同影響，UV-C脅迫促使蝦頭內(nèi)源性蛋白酶中酶原或者新種類蛋白酶被激活，以致總酶活的提高。
　　(2)研究確定了凡納濱對蝦蝦頭自降解最佳工藝條件為固液比1∶3(m∶v)、pH8.5以及溫度55℃。建立了UV-C脅迫后蝦頭自降解動力學(xué)方程Y

5、=37.681e-0.173t，上清液中蝦頭蛋白釋放量和3000 Da以下自降解產(chǎn)物與固體殘余蛋白量在自降解過程中具有良好的線性相關(guān)性。利用絕對溫度和速率常數(shù)建立Arrhenius方程lnKa=8090.2/T-26.497，驗(yàn)證了建立的UV-C脅迫后蝦頭自降解動力學(xué)方程的正確性。
　　(3)研究了UV-C脅迫后基于蝦頭內(nèi)源性酸性蛋白酶自降解溶出產(chǎn)物規(guī)律。UV-C脅迫后蝦頭基于酸性蛋白酶自降解2h基本完成，在5h內(nèi)結(jié)束。UV-C脅

6、迫后蝦頭基于酸性蛋白酶自降解蛋白釋放量、3000 Da以下自降解產(chǎn)物和水解度在1h內(nèi)迅速增加，隨后增加的趨勢變緩。2h后3000Da以下自降解產(chǎn)物和水解度依然有明顯的增加趨勢。自降解過程中人體必需的8種氨基酸含量均增加了2～3倍。
　　(4)研究了基于蝦頭內(nèi)源性消化蛋白酶自降解制備短肽體系的建立，結(jié)果表明:UV-C脅迫后利用蝦頭內(nèi)源性消化蛋白酶自降解制備短肽過程設(shè)計(jì)為:基于酸性蛋白酶自降解1.5h，隨后轉(zhuǎn)入基于堿性蛋白酶自降解1.

7、5～5h制備短肽。蛋白釋放量、水解度和3000Da以下自降解產(chǎn)物均顯示2次明顯增加趨勢?；谖r頭內(nèi)源性消化蛋白酶自降解制備短肽過程中，蝦頭蛋白經(jīng)過自降解1.5 h，生成產(chǎn)物大部分分子量集中在2000～3000 Da左右，經(jīng)過自降解4～5h后，3000 Da以下組分增加了51.3％，且多集中在分子質(zhì)量1000 Da左右。
　　(5)研究了基于蝦頭內(nèi)源性消化蛋白酶自降解制備短肽的功能特性、氨基酸組成以及在Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)狀況，結(jié)果

8、表明:短肽溶解性良好，35～50℃區(qū)間短肽NSI值隨溫度增加而增加，50℃時(shí)自降解制備短肽的氮溶解指數(shù)為97.9％，pH對其影響較小。0～1000Da分子量區(qū)間短肽的氨基酸組成和含量與1000～3000Da分子量區(qū)間短肽基本一致，短肽氨基酸組成中必需氨基酸含量均在36％以上。自降解短肽在Caco-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)以被動轉(zhuǎn)運(yùn)為主，屬于濃度依賴性。自降解短肽以1 mg/mL濃度添加，轉(zhuǎn)運(yùn)2h，0～1000Da分子量區(qū)間自降解短肽跨Caco-2細(xì)