人類SPATA12基因在UV-C誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)中的作用研究.pdf

1、基因組DNA的遺傳穩(wěn)定性是維持正常的細胞復(fù)制、增殖和分化的關(guān)鍵。外源因素和內(nèi)源因素造成的DNA損傷及其修復(fù)失敗，是各種遺傳疾病發(fā)生的根本原因。其中，內(nèi)源因素包括DNA復(fù)制錯誤、細胞代謝活動產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)（如自由基）。外源因素包括紫外線、放射線、藥物和病毒等。目前認為，DNA損傷應(yīng)答與修復(fù)是一個涉及多種相關(guān)基因精細調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，研究這些相關(guān)基因在此過程中的機制和特性，對于闡明DNA損傷與疾病發(fā)生的關(guān)系具有重要意義。
　　 SPA

2、TA12基因(Spermatogenesis Associated Gene12，SPATA12)是一個精子發(fā)生相關(guān)基因，主要定位于初級精母細胞和精子細胞中。在人類染色體上，SPA TA12定位于一個重要的抑癌基因侯選區(qū)域3p14。我們前期的研究工作發(fā)現(xiàn)，SPATA12可能作為抑制因子在精子發(fā)生或腫瘤發(fā)生中起作用。通過酵母雙雜交技術(shù)，我們課題組篩選到一個與SPATA12相互作用的蛋白CHD2。已知CHD2是一個染色質(zhì)重塑因子，可以通過影

3、響p53的轉(zhuǎn)錄活性來參與DNA損傷應(yīng)答途徑的后期階段反應(yīng)?；谝陨涎芯勘尘?，本論文主要探討了SPATA12與CHD2的關(guān)系以及SPA TA12在DNA損傷中的作用及其機制。研究工作主要包括以下三個方面:
　　 1.SPATA12與CHD2相互作用的確定
　　 通過分別構(gòu)建SPATA12-EGFP融合熒光蛋白和CHD2-DsRed融合熒光蛋白，利用基因轉(zhuǎn)染和激光共聚焦技術(shù)，共定位實驗顯示CHD2與SPATA12共同定位于細

4、胞核，在空間上具備相互作用的基礎(chǔ);通過雙分子熒光互補技術(shù)證實了二者在核內(nèi)相互結(jié)合的真實性。
　　 2.紫外UV-C誘導(dǎo)的細胞DNA損傷模型的建立
　　 通過MTT、PI雙染、流式細胞術(shù)以及單細胞凝膠電泳技術(shù)，分別從細胞行為與功能、DNA結(jié)構(gòu)完整性等方面進行綜合分析，成功建立了一個合適的紫外(UV-C)誘導(dǎo)的DNA損傷模型。
　　 3.SPATA12應(yīng)答DNA損傷反應(yīng)的作用及機制
　　 通過RT-PCR和W

5、estern bloting實驗我們發(fā)現(xiàn)，在Hela和MCF-7細胞中，SPATA12能夠被UV-C誘導(dǎo)而重新表達。通過克隆形成、細胞劃痕和宿主活細胞再活化實驗，發(fā)現(xiàn)在UV-C誘導(dǎo)的DNA損傷中，外源表達的SPATA12能夠抑制細胞增殖和克隆形成率。通過雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)和AP-1 decoy ODNs技術(shù)，從正反兩個方面證實了SPATA12可通過其啟動子區(qū)域的AP-1結(jié)合位點來實現(xiàn)對UV-C損傷的應(yīng)答。進而，我們將SPATA1

6、2基因分別轉(zhuǎn)染H1299細胞(p53null)、Hela細胞(p53 functional deletion)和MCF-7細胞(p53 WT)中，進行流式細胞儀分析，結(jié)果提示SPA TA12在應(yīng)答UV-C誘導(dǎo)DNA損傷的過程中，其對細胞增殖的抑制作用可能是p53依賴性的。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)外源表達SPATA12能夠促進p53的表達，顯示SPATA12可能通過促進p53的表達來阻滯細胞周期進程。
　　 綜上，我們證實了SPATA