熱處理對乳鐵蛋白結構及促成骨細胞增殖活性的影響.pdf

1、乳鐵蛋白是牛乳中一種重要的堿性蛋白,相關基礎與應用研究已引起廣泛關注。乳鐵蛋白(bLF)作為一種新型的骨生長因子,通過調(diào)節(jié)骨的生長和代謝過程發(fā)揮其功能,促進骨骼生長。熱處理在乳制品加工工業(yè)中十分常見,但熱處理對乳鐵蛋白促成骨細胞增殖活性的影響未見報道。本研究以新鮮牛乳為原料通過系列組合技術純化乳鐵蛋白,通過圓二色譜、差式掃描量熱等技術研究經(jīng)過不同熱處理的bLF的分子結構及性質(zhì)的變化,并采用MTT法進行成骨細胞增殖實驗,考察不同加熱處理條

2、件對乳鐵蛋白促成骨細胞增殖活性的影響。
　　本研究首先以鮮牛乳為原料,通過脫脂、除酪蛋白、SP Sepharose Big Bead陽離子交換層析及Superdex200凝膠層析組合方法、超濾濃縮等方法,制備獲得乳鐵蛋白,最終純度為94.71％。進而,研究了熱處理對乳鐵蛋白的分子特性的影響。通過差示掃描量熱法測定得到的乳鐵蛋白熱變性溫度為73.1℃。結合實際生產(chǎn)中的熱處理參數(shù),設置加熱參數(shù)62~65℃/30min;72℃/10s;

3、85℃/10min;95℃/10min。通過電鏡觀察和激光粒度儀測定發(fā)現(xiàn),隨著加熱處理溫度的升高,形成的蛋白聚集體粒徑增大,即bLF發(fā)生自身熱聚集的程度增強。通過圓二色譜研究了熱處理對乳鐵蛋白二級結構的影響,結果表明,隨著處理溫度的增加,乳鐵蛋白的α-螺旋構象逐步轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊構象,蛋白質(zhì)分子排列更為有序,分子的結構變得更加緊密,蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性趨勢明顯增加。通過熒光分光光度測定熱處理對bLF的表面疏水性的影響,結果表明隨著處理溫度的

4、升高,蛋白表面疏水性先降低再升高,接近變性溫度時,疏水性達到最低。
　　采用酶原消化法從新生SD大鼠乳鼠顱蓋骨中提取培養(yǎng)成骨細胞后,采用MTT法進行細胞增殖實驗,比較不同加熱處理條件對乳鐵蛋白促成骨細胞增殖活性的影響。顯微鏡下觀察成骨細胞形態(tài),多有2~3個突起,呈長梭形或三角形。通過HE染色、堿性磷酸酶染色以及礦化結節(jié)染色來鑒定所提取的細胞為成骨細胞。促細胞增殖研究表明,未加熱乳鐵蛋白能顯著促進成骨細胞增殖,且在50~500μg/

5、mL范圍內(nèi)呈劑量依賴關系;在24、48、72h不同時間節(jié)點上LF對成骨細胞的作用有所差異。與未加熱乳鐵蛋白相比,經(jīng)過65℃加熱處理30min和72℃加熱處理10s對于牛乳鐵蛋白的活性幾乎無影響;而乳鐵蛋白分別經(jīng)過85℃處理10min和95℃處理10min后對于其活性顯著降低,而且與低質(zhì)量濃度的實驗組相比,熱處理對高質(zhì)量濃度的乳鐵蛋白實驗組影響較大。
　　本研究通過闡述熱處理對乳鐵蛋白結構、性質(zhì)及促成骨細胞增殖活性的影響,為乳鐵蛋白