谷胱甘肽的發(fā)酵生產(chǎn)及其分離純化.pdf

1、谷胱甘肽(L-Glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的具有多種重要生理功能的活性三肽。GSH具有清除自由基、延緩衰老、解毒和抗疲勞等多種生理功效，在臨床上用于肝臟保護、治愈腫瘤和治療內(nèi)分泌紊亂等疾病。目前，谷胱甘肽生產(chǎn)方法有萃取法、化學合成法、發(fā)酵法和酶法，其中發(fā)酵法因其成本低、產(chǎn)量高、易分離、低污染等優(yōu)點，己成為生產(chǎn)谷胱甘肽的主要方法。 本文以富含GSH的釀酒酵母LC-011為材料，以細胞密度和G

2、SH的高產(chǎn)量、高產(chǎn)率為目標，采用一系列可行性方案來提高細胞密度和GSH的胞內(nèi)含量，研究的主要內(nèi)容及結(jié)果如下:采用紫外誘變和NaN02交替復合誘變，通過ZnCl2和乙硫氨酸的抗性篩選，選育出了高產(chǎn)GSH菌株NU-08，將菌株NU-08和實驗室保藏的假絲酵母SJ-209進行原生體制體融合，在0.5mol/L的蔗糖高滲緩沖液中酶解90min，NUD-08原生質(zhì)體形成率為92.4％，再生率為8.9％，SJD-209原生質(zhì)體形成率為88.5％，再

3、生率為11.3％；通過融合和篩選最終得到一株融合子R-203，其GSH產(chǎn)量為328.7lmg/L，比出發(fā)菌株分別提高了20.46％和55.9％。
　　對融合菌株R-203發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，經(jīng)過單因素試驗、Box-Benhnken設(shè)計和響應(yīng)面分析優(yōu)化之后，確定發(fā)酵培養(yǎng)基中幾個重要營養(yǎng)成分的百分含量分別是葡萄糖4.43％，酵母粉2.O9％，谷氨酸濃度7.67mmol/L，甘氨酸濃度4.48mol/L，L-半胱氨酸濃度9.

4、15mmol/L，最佳培養(yǎng)條件為溫度30℃、裝液量30mL/250mL、初始pH5.5、接種量5％、培養(yǎng)時間31h。通過優(yōu)化，培養(yǎng)條件優(yōu)化后GSH產(chǎn)量和生物量比優(yōu)化前分別提高了108.96％和0.25％。
　　采用1OL-微生物自動發(fā)酵罐與搖瓶相比發(fā)酵周期明顯縮短，而且GSH產(chǎn)量也有所提高，在發(fā)酵罐中發(fā)酵24h谷胱甘肽產(chǎn)量達到最大為720.91mg/L與搖瓶發(fā)酵的最高產(chǎn)量(發(fā)酵時間56h)689.29mg/L相比提高了4.59％。

5、補料發(fā)酵與分批發(fā)酵相比，雖然菌體R-203的發(fā)酵周期延長，但生物量、GSH產(chǎn)量以及胞內(nèi)谷胱甘肽含量都有著明顯的提高。流加補料培養(yǎng)基Ⅰ和Ⅱ工生物量、GSH產(chǎn)量以及胞內(nèi)谷胱甘肽含量與分批發(fā)酵相比分別提:高了98.48％、161.41％、31.71％和107.71％、175.59％、32.6g％。
　　研究表明，采用乙醇提取酵母中的還原型谷胱甘肽是簡單有效的方法。此方法提取GSH損失少，蛋白質(zhì)、色素、核酸等雜質(zhì)溶出少，所得樣品純度較高，

6、有益于后續(xù)的分離純化，并且乙醇可回收利用，降低了成本。由實驗結(jié)果可知，在40℃，pH1.0，乙醇濃度50％條件下提取40min，能有效地提取GSH，采用二次提取法驗證其提取率達到95.4％。
　　強酸型離子交換樹脂HD-8能夠較好的分離與純化谷胱甘肽，實驗表明，在pH為
　　2，上樣速度1mL/min，用5％的鹽酸控制洗脫速度0.5mL/min谷胱甘肽得到較好的分離純化效果，其蛋白質(zhì)去除率約64.71％，最高濃縮倍數(shù)為5.4